表达高致病性猪蓝耳病GP3、GP5基因DNA疫苗构建及实验免疫研究

发布时间：2020-07-07 22:41

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起猪繁殖与呼吸综合征,其特征是易感猪生殖健康状况变差,死亡率升高,特别是在幼龄动物和呼吸系统疾病中。它是世界范围内猪肉生产国的重要疾病,导致母猪繁殖失败和仔猪呼吸道疾病,这会导致区域性疾病的发生和慢性经济损失。GP5蛋白分子量约为25kDa,含有中和抗原表位,通常认为中和抗体的产生与它密切相关。GP3是分子量约为28kDa的高度糖基化结构蛋白,通常认为它对可能影响蛋白的中和活性。该病毒具有已知最高的RNA病毒突变率之一,是开发保护性疫苗的主要障碍,DNA疫苗在疫苗生产中显示了较好的应用前景,可引起宿主产生体液免疫及细胞免疫的免疫应答反应,以达到预防和治疗疾病的目的。本试验以美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD株GP3、GP5基因为研究对象,以pVAX1为载体,构建重组核酸疫苗质粒pVAX-N35HP,并对构建的质粒进行鉴定。将鉴定正确的核酸疫苗质粒pVAX-N35HP与佐剂A1、A2、A3、A4、A8联合使用,免疫分组为pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2、pVAX-N35HP+A3、pVAX-N35HP+A4和pVAX-N35HP+A8,对小鼠及健康仔猪的免疫效果进行评价。实验期间小鼠每周采血分离血清,检测中和性抗体、GP3和GP5抗体、IL-4及IFN-γ水平;处死后分离脾淋巴细胞进行T淋巴细胞亚群数量的检测。结果表明,pVAX-N35HP+A3组中和性抗体滴度最高,达到1:16,与商品化灭活疫苗抗体滴度相同;pVAX-N35HP+A3组IL-4水平达到165.74 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组;IFN-γ水平达到342.67 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组;淋巴细胞亚群检测结果显示,pVAX-N35HP+A1组具有最高CD3~+CD4~+T淋巴细胞百分数,为24.37%,略低于商品化灭活疫苗组;pVAX-N35HP组具有最高CD3~+CD8~+T淋巴细胞百分数,达到45.21%,高于商品化灭活疫苗组T细胞百分数。表明pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3可引起小鼠较强的细胞免疫和体液免疫,具有良好的免疫效果。选择小鼠免疫效果较好的pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3免疫仔猪,进行猪体免疫效果评价。免疫后仔猪每周前腔静脉采血,分离血清进行中和性抗体和细胞因子等检测,35天时无菌分离外周血淋巴细胞进行T细胞亚类鉴定,同时准备攻毒保护试验,攻毒毒株为PRRSV GD株,攻毒剂量2×10~5TCID_(50)。攻毒后每天检测仔猪直肠体温,观察仔猪健康状态,14天后剖杀猪只,采集心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结进行病毒载量检测,制作肺部组织病理切片。结果显示,pVAX-N35HP+A1组和pVAX-N35HP+A3组具有最高的中和抗体滴度,达到1:18,低于商品化灭活疫苗组,但统计差异不显著(p0.05);pVAX-N35HP+A1具有最高的IFN-γ水平,达到227.37 pg/μl,是pVAX-N35HP组1.22倍,但统计学差异不显著(p0.05),高于商品化灭活疫苗组,统计学差异显著(p0.05);pVAX-N35HP+A3组IL-4水平最高,为136.77 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组,且统计学差异极显著(p0.01);pVAX-N35HP+A1组CD3~+CD4~+T淋巴细胞百分数为36.16%与商品化灭活疫苗组统计学无差异(p0.05);pVAX-N35HP+A3组CD3~+CD8~+T淋巴细胞百分数达到62.37%,略高于商品化灭活疫苗组,统计学无差异(p0.05);攻毒后每日观察仔猪状态,各免疫组体温及健康状态均好于阴性对照组;攻毒后14天,检测组织内病毒载量,肺部检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为2.14×10~3 copies/g,低于商品化灭活疫苗组,pVAX-N35HP组、pVAX-N35HP+A2组和pVAX-N35HP+A3组高于商品化灭活疫苗组但处于相同数量级。颌下淋巴结检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为7.25×10~3 copies/g,低于商品化灭活疫苗组。腹股沟淋巴结检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为8.70×10~3 copies/g,低于商品化灭活疫苗组。肺部病理切片结果显示各免疫组肺部结构均好于阴性对照组。pVAX-N35HP+A3可显著提高仔猪体内细胞免疫和体液免疫水平,强毒攻击时显示良好的保护效果,可作为预防和保护仔猪免受高致病性猪繁殖与呼吸综合征的候选疫苗,为未来的疫苗研制提供参考。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28
【图文】：

优化后（图 2.1）蛋白亲脂性相比优化前（图2.1A）更强，可能更有利于 GP3、GP5 蛋白的表达，密码子优化成功。图 2.1 蛋白亲水性分析Fig. 2.1 Protein hydrophilicity analysis1.3.2 重组质粒 pVAX-N35HP 的构建及酶切鉴定质粒 pVAX-N35HP 构建过程如图 2.2，pVAX-N35HP 重组质粒经 Xba I、HindIII 双酶切，获得 1 504 bp 的目的片段（图 2.3）。测序验证，重组质粒构建正确。

图 2.2 DNA 疫苗重组质粒构建过程示意图Fig. 2.2 Construction of recombinant DNA vaccine图 2.3 pVAX-N35HP 酶切结果A. λ—EcoT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP 质粒 XbaI+HindIII 酶切D. pVAX-N35HP 质粒 HindIII 酶切

图 2.3 pVAX-N35HP 酶切结果oT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP 质粒 XbaI+D. pVAX-N35HP 质粒 HindIII 酶切Fig. 2.3 Enzyme-digestion result of pVAX-N35HPcoT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP recombina Xba I+HindIII D. pVAX-N35HP recombinant plasmid enHindIII

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