不同年龄骨骼肌卫星细胞的分化能力及调控机制研究

发布时间：2020-07-08 19:14

【摘要】：骨骼肌作为一类横纹肌,是生物体中最重要的运动器官,而畜禽的骨骼肌不仅可以作为重要的运动器官,还是人类摄取优质蛋白质的重要来源之一,因此对畜禽骨骼肌发育的研究就显得尤为重要。卫星细胞作为动物骨骼肌的祖细胞,是一类未分化的单核细胞,定位于肌纤维基膜和肌细胞膜之间的间隙,紧紧粘附于肌纤维。卫星细胞可以参与肌纤维的发育并为其所附着的肌纤维提供细胞核。动物出生后骨骼肌中的卫星细胞会逐渐转为静息状态。当肌纤维受损时,卫星细胞可以被激活并开始进行不对称分裂,一部分子细胞进入细胞循环开始大量增殖并进行肌源性分化,参与肌纤维的再生;另一部分子细胞则退出细胞循环转为静息状态,进行自我更新,从而维持处于静息状态的卫星细胞数目的稳定,因此卫星细胞具有干细胞的特性,是一种肌源性的祖细胞。本研究用C57/BL6小鼠为模型,在细胞水平和组织水平探讨骨骼肌发育过程中卫星细胞的分化能力以及调控机制,并对猪骨骼肌卫星细胞的发育规律进行了初步研究。取得了以下结果:(1)哺乳动物出生后骨骼肌中PAX7~+细胞数目逐渐减少。本研究选取出生后1天、8天、2周、4周、6周、8周、10周、12周、24周以及52周共10个时间点的小鼠的腓肠肌进行组织切片免疫荧光检测,结果发现,PAX7~+细胞数目在小鼠出生后1天时约为19.7%,但随着年龄的增长显著下降,在大于10周龄的小鼠中PAX7~+细胞数目的比率则稳定在0.5%以下。(2)出生后小鼠卫星细胞中MYF5、MYOD以及myogenin的表达模式。本研究对不同年龄小鼠腓肠肌进行组织切片免疫荧光检测,结果发现,MYF5~+细胞数目在小鼠出生1天到8周龄虽然有轻微的下降,但总体维持在较高水平,而在10周龄后则显著下降。MYOD~+细胞数目在小鼠出生后不同的年龄段均维持在一个较低的水平。Myogenin~+细胞数目在小鼠出生后1天到2周显著下降,但在4周和6周时显著上升,随后又显著下降。(3)骨骼肌卫星细胞的分化能力随着年龄的增长而下降。本研究选取出生后2周、4周、6周、8周、10周以及12周共6个时间点的小鼠腿肌用于卫星细胞的分离和培养,然后利用免疫荧光和Q-PCR实验检测卫星细胞的分化能力。免疫荧光和Q-PCR结果表明,骨骼肌卫星细胞被诱导分化24 h和48 h后,分化标志基因Mck和肌浆球蛋白(myosin)的表达水平随着小鼠年龄的增长而呈现逐渐下调的趋势。(4)不同时期卫星细胞的差异表达基因鉴定。本研究分离了2周、4周、6周、8周、10周以及12周六个时间点的小鼠腿肌卫星细胞,并对其进行转录组分析。通过基因差异表达分析,本研究共得到了2907个DEGs。WGCNA分析发现,这2907个DEGs可以被富集到6个主要的表达模块,其中有1739个基因被富集到红色模块,且红色模块中的基因多与骨骼肌的发育过程相关(p0.01)。Pathway分析表明这1739个差异基因主要富集到12个信号通路(p0.01),包括细胞粘附,肥厚型心肌病,Wnt以及MAPK等。综合Q-PCR验证分析和共表达网络分析,本研究筛选出三个关键基因,即Tgfβ2、Wnt9a和Fgfr4。(5)TGFβ2、TGFβ3以及WNT9a可以有效地抑制卫星细胞的分化。在细胞水平,卫星细胞分化时期Tgfβ2、Tgfβ3、Wnt9a、Akt2和Mknk2的表达水平与增殖期相比显著上调;利用si-RNA或Pirfenidone抑制TGFβ2、TGFβ3和WNT9a可以显著促进肌管的形成和MyHC2d以及Mck基因的表达。在组织水平,利用Pirfenidone抑制小鼠体内TGFβ2蛋白的表达可以有效地促进卫星细胞的激活和分化,从而促使卫星细胞与肌管融合以及骨骼肌的再生。(6)FGFR4可以有效地促进卫星细胞的分化。在卫星细胞分化时期Fgfr4基因的表达与增殖期相比显著上调。在卫星细胞中抑制FGFR4蛋白表达可以显著抑制肌管的形成和分化marker基因MyHC2d以及Mck的表达。(7)TGFβ2、FGFR4以及WNT9a通过影响卫星细胞的激活状态来调控骨骼肌的发育。本研究利用si-RNA抑制卫星细胞中TGFβ2、TGFβ3、FGFR4和WNT9a蛋白的表达,或利用Pirfenidone抑制细胞水平和组织水平TGFβ2的表达。Western blotting结果表明,TGFβ2、TGFβ3和WNT9a可以促进PAX7的表达,抑制MYOD的表达;FGFR4可以抑制PAX7的表达,促进MYOD的表达。(8)TGFβ2,FGFR4和WNT9a蛋白之间具有相互调节作用。Western blotting结果表明,TGFβ2可以抑制FGFR4、WNT9a、AKT2和MKNK2蛋白的表达;FGFR4可以抑制TGFβ2和WNT9a的表达,促进AKT2和MKNK2蛋白的表达;而WNT9a可以促进TGFβ2和FGFR4的表达,但是对AKT2和MKNK2蛋白水平的影响不显著。(9)对猪骨骼肌卫星细胞的初步研究。本研究选取大白猪胚胎35天、胚胎55天、出生1天、1月龄、2月龄、3月龄、6月龄以及12月龄共八个时间点的背最长肌进行免疫荧光检测。结果表明,MYF5~+细胞数目随着骨骼肌的发育逐渐减少;MYOD~+细胞数目在胚胎期55天最高,但是在其它时期均较低;myogenin~+细胞数目从胚胎期到出生后逐渐下降。本研究通过对分离培养的卫星细胞进行诱导分化发现,MYOD和myogenin作为分化早期marker,在细胞分化启动时表达上调,随后又显著下调。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.2
【图文】：

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Fig. 1. Muscle structure and the location of satellite cell.骨骼肌卫星细胞的来源骼肌卫星细胞的首次发现是在 1961 年。Mauro 在利用电镜观察青蛙骨骼肌现了一类与肌纤维紧密粘附的单核细胞。这些细胞在肌纤维表面形成突起肌纤维膜和肌纤维基膜之间的空隙，并且细胞膜与基膜和肌纤维膜接触但类细胞因其与肌纤维的位置关系而被 Mauro 命名为卫星细胞（Mauro 196星细胞发现以来，其在骨骼肌发育过程中发挥的作用越来越受到人们重视祖细胞的发育分为胚胎期和出生后两个阶段，胚胎期的细胞称为骨骼肌前而出生后则称为卫星细胞。Pax3 和 Pax7 是骨骼肌祖细胞的 marker 基因，的发育以及卫星细胞特性的维持等方面具有重要的作用。研究表明，体节来源于轴旁中胚层和中胚层背侧，而体节背侧可以发育成骼肌组织，因此被称为生皮肌节（Christ and Ordahl 1995, Daughters et al. 20

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图 3. 卫星细胞异质性分裂示意图Fig 3. Schematic diagram of asymmetric division of satellite cells很多研究都表明了肌纤维的再生能力取决于卫星细胞的增殖和分化能力以及自新能力。Collins 等人将新鲜完整的肌纤维移植到肌营养不良的小鼠骨骼肌部位发现供体小鼠的肌纤维移植后，肌纤维表面的卫星细胞被激活并且开始大量增然后进行肌源性分化形成新的肌纤维从而补充受体小鼠肌纤维的不足（Collins 005）。而在小鼠骨骼肌中特异消融 PAX7 阳性的卫星细胞，骨骼肌纤维的再生能显著抑制（Lepper et al. 2011）。Lepper 等人利用细胞标记追踪技术研究了 PAX星细胞参与的骨骼肌再生过程中的作用。Christoph Lepper 用 β-gal 标记 PAX的卫星细胞，并利用 CTX 对肌纤维进行损伤，研究发现在肌纤维再生的过程中的肌纤维均为 β-gal 阳性，表明 PAX7 阳性细胞是骨骼肌再生过程中主要的细胞（Lepper et al. 2009）。Guitart 等人研究了在小鼠骨骼肌损伤过程中卫星细胞的，发现在受损伤的骨骼肌中增殖状态的 PAX7+卫星细胞显著增加，并且通过电

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17图 4.本研究的技术路线Fig 4 The scheme of this study2.2 实验动物本实验所用到的 C57/BL6 雌性小鼠（SPF 级）购自湖北省疾病预防控制中心。其中组织样本来源于 10 个不同年龄的小鼠，即出生后 2 天（2 d）、8 天（8 d）、2 周（2 w）、4 周（4 w）、6 周（6 w）、8 周（8 w）、10 周（10 w）、12 周（12 w）、24周（24 w）以及 52 周（52 w）。我们从每个年龄段的小鼠的腿肌取三份组织样品：两份（全部腿肌组织样）用液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱保存，用于后续 Q-PCR和 Western blotting 的研究；一份（腓肠肌组织样）保存在 4%多聚甲醛缓冲固定液中，用于免疫组织化学的研究。本实验用于分离卫星细胞的小鼠腿肌样本来源于 6个不同年龄的小鼠，即出生后 2 周（（2 w）、4 周（4 w）、6 周（6 w）、8 周（8 w）、

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