蜱体内携带弓形虫的分子检测

发布时间：2020-07-08 18:29

【摘要】：刚地弓形虫是一种原生动物寄生虫,也是常见的一种人畜共患病。根据流行病学调查我们普遍认为只感染温血动物。但是,从远离猫粪污染的草食动物和鸟类的流行病学调查也显示出高感染率。实验室前期研究显示,媒介节肢动物蜱可作为弓形虫在自然界的保存宿主。为全面了解自然条件下,蜱体感染弓形虫的情况,本研究开展不同地点、不同宿主来源和不同种类的蜱体携带弓形虫的分子检测,并对阳性样本中的弓形虫基因进行分型,以期为弓形虫流行病学研究提供资料。(1)本研究对1275份蜱DNA样品进行定量PCR分子检测,共发现88份为阳性样本,阳性率为6.90%。其中检测的吸血蜱样本总数为848份,阳性样本数为55份,阳性率为6.49%;检测的未吸血蜱样本总数为427份,阳性样本数为33份,阳性率为7.73%。(2)在吸血蜱中,成蜱携带弓形虫的阳性率为7.69%,若蜱携带弓形虫的阳性率为1.90%;幼蜱携带弓形虫的阳性率为0;在未吸血蜱中,成蜱携带弓形虫的阳性率为7.96%,若蜱携带弓形虫的阳性率为0;幼蜱携带弓形虫的阳性率为14.29%。(3)不同蜱种的阳性率差异并不大。在吸血蜱中,长角血蜱携带弓形虫的阳性率为8.05%;血红扇头蜱携带弓形虫的阳性率为7.50%;镰形扇头蜱携带弓形虫的阳性率为12.12%;微小牛蜱携带弓形虫的阳性率为0;草原革蜱携带弓形虫的阳性率为10%;褐黄血蜱携带弓形虫的阳性率为3.07%;血蜱属携带弓形虫的阳性率为20%;扇头属携带弓形虫的阳性率为5.22%以及未鉴定蜱种携带弓形虫的阳性率为0。在未吸血蜱中,长角血蜱携带弓形虫的阳性率为7.67%;血红扇头蜱携带弓形虫的阳性率为8.7%;镰形扇头蜱携带弓形虫的阳性率为8.33%;扇头属携带弓形虫的阳性率为6.25%以及未鉴定蜱种携带弓形虫的阳性率为0。(4)对所有通过定量PCR检测显示出携带弓形虫的阳性样本再用巢式PCR方法进行检测,均成功扩增出目的条带,将目的条带进行胶回收并送测序,测序所得结果与数据库标准序列进行比对,与弓形虫529-bp重复序列片段相似程度高达99%以上。说明所有阳性样本均携带弓形虫。(5)采用巢式PCR方法对所有使用定量PCR方法检测出携带弓形虫的阳性样本进行基因分型,结果显示所有阳性样本均为弓形虫ME49虫株,即弓形虫Ⅱ型弱毒株。(6)构建吸血蜱阳性样本与未吸血蜱阳性样本数据进化树,并对数据进行卡方检验分析其显著差异性。发现吸血蜱与未吸血蜱之间的差异不显著。综上所述,本研究发现自然界蜱感染弓形虫较为普遍,蜱总体感染阳性率为6.90%;在检测的6种硬蜱中,5种蜱均感染,不同蜱种的阳性率无显著差异;在蜱的三个不同发育阶段,相较而言成蜱感染率较高,吸血蜱与未吸血蜱之间的差异不显著。基因分型结果显示,所有阳性样本均为弓形虫Ⅱ型。根据实验结果我们可以发现蜱携带弓形虫在流行病学中具有重要意义,人类弓形虫感染需要高度重视。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.7
【图文】：

样本数,血蜱,血红扇头蜱,草原革蜱

将吸血蜱和未吸血蜱根据不同发育阶段进行分类统计，鉴定出蜱种的包括长角血逡逑蜱、血红扇头蜱、镰形扇头蜱、微小牛蜱、草原革蜱以及褐黄血蜱，其余为鉴定为扇头逡逑属、血蜱属以及未鉴定出种属的蜱样本（图１－１）。逡逑ＩＳ３吸血蜱逡逑４００１逡逑Ｅ３末艰血蜱逡逑３00逡逑毅逦Ｕ逡逑掩邋２００邋Ｍ邋ｐｇ逡逑ｇ：邋ｐｉＭ邋Ｉ逡逑＊邋ｉ0．邋（Ｉ邋｜邋Ｉ逡逑0邋ＩＪ邋１邋目W邋ｗｉ逦ｒａ邋＿邋ｍ，邋ｃａ逡逑图１－１不同蜱种采集到蜱样本数逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｔｉｃｋ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑

宿主,样本数,样本

２．４不同宿主蜱样本数逡逑将吸血蜱样本和未吸血蜱样本根据不同宿主进行分类汇总，宿主只要分为犬、牛羊逡逑以及游离蜱（图１－２）。逡逑６００－｜逡逑0吸血蜱逡逑＿逦Ｅ３３未吸血蜱逡逑Ｉ邋４００＇逦Ｉ逡逑Ｊ逦Ｉ逦ｉ逦｜逡逑慑螊p逦Ｉ逡逑０逦ｍｍ逦＿＿逦Ｍ逡逑十邋＆逦＆邋香令逡逑图１－２不同宿主采集到蜱样本数逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｔｉｃｋ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｈｏｓｔｓ逡逑根据上图可知：采集到宿主为犬的吸血蜱样本有５００份，未吸血蜱样本有１１８份；宿逡逑主为牛的吸血蜱样本有４８份，而未吸血蜱没有；宿主为羊的吸血蜱样本为３００份，未吸逡逑血蜱没有；另外采集到的游离蜱样本有３０９份。逡逑２．５不同发育阶段蜱样本数逡逑将吸血蜱和未吸血蜱根据不同发育阶段进行分类汇总，蜱主要分为幼蜱、若蜱以及逡逑成蜱三个发育阶段，采集到的吸血蜱均为叮咬在宿主体表，或腹部肿胀充盈的蜱。采集逡逑到的未吸血蜱主要是粘附在宿主皮毛而未叮咬在皮肤上，或者腹部干瘪的游离蜱。（图逡逑１－３）。逡逑

样本数,凝胶成像分析系统,样本,琼脂糖凝胶电泳

２．６蜱样本ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测逡逑对定量ＰＣＲ后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，使用全自动凝胶成像分析系统逡逑Ｇｅｌ邋Ｄｏｃ邋ＥＺ对目的条带进行观察（图１－４）。逡逑Ｍ邋１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逦８逦９逦１０逦１１逦１２逦１３逦１４逦１５邋１６逡逑■■■■逡逑ＩＩ—逡逑图１－４蜱ＤＮＡ样本琼脂糖凝胶电泳图逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｔｉｃｋｓ邋ＤＮＡ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ逡逑

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