与猪腹股沟阴囊疝相关遗传标记的研究

发布时间：2020-07-08 14:28

【摘要】：猪腹股沟/阴囊疝是一种常见的影响养猪业经济效益的发育异常疾病,主要发生在鞘状突和腹股沟管的薄弱部位。该病是由遗传和环境因素共同作用产生的,但目前对影响猪腹股沟/阴囊疝的遗传机制却知之甚少。本研究利用实验室前期对120头猪只个体(59头患病个体和61头健康个体)进行特异性位点扩增片段测序(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing,SLAF-seq)的结果进行全基因组关联分析,并对猪腹股沟/阴囊疝的易感基因进行筛选和功能验证。主要研究结果如下:1.将120个样本分成三个群体(group 1:患病个体与健康个体;group 2:患病大约克猪,健康大约克猪,患病长白猪,健康长白猪患病杂交猪和健康杂交猪;group 3:患病法系猪,健康法系猪,患病美系猪与健康美系猪),利用FarmCPU(fixed and random model Circulating Probability Unification)模型进行全基因组关联分析,选择两种不同的阈值对关联结果进行筛选。当筛选阈值为系统默认值p.threshold=0.01/标记数时,共鉴定到21个与腹股沟/阴囊疝显著关联的SNPs(P0.01),定位了 9 个易感基因(AUH,TMPRSS3,UBASH3A,PTPN20B,VWA3B,NOL10,TENM3,PLCG2和NUAK)当筛选阈值为推荐值 p.threshold=1E-05 时,共鉴定到6个新的与腹股沟/阴囊疝显著关联的SNPs(P0.01),定位了 3个新的易感基因(DEGS1,MEPE和PRKCE)。上述结果均经过QQ图检验假阳性程度,发现统计结果与预测值拟合良好,关联结果可靠。2.针对筛选出的5个与细胞凋亡相关基因(DEGS1,PLCG2,PRCE,NUAK1和TENM3)进行扩大群体验证。结果发现,在总群体和法系大约克猪中,PRKCE基因多态位点的基因型和等位基因频率在患病、正常两组中的分布差异显著(P0.05);在所有群体中,DEGS1基因多态位点的等位基因频率以及基因型频率的分布与阴囊疝的发生并没有显著的关联(P0.05);在法系群体和法系长白群体中,NUAK1基因多态位点的基因型的分布差异显著(P0.05);在总群体中,PLCG2基因多态位点的基因型的分布差异显著(P0.05);在法系群体、法系长白群体和多元杂交群体中,TENM3基因多态位点的基因型分布差异显著(P0.05),而且在总群体和美系群体中,该基因多态位点的基因型分布差异极显著(P0.01)。3.根据转录因子预测结果,选择TENM3基因作为腹股沟/阴囊疝候选基因进行初步功能研究。利用NNPP网站在线预测TENM3基因可能的核心启动子区域,与pGL3-Basic构建重组载体,通过双荧光活性检测发现TENM3-2片段的荧光活性最高(P0.01),将其定义为TENM3基因的核心启动子区域。构建包含核心启动子TENM3-2和不同基因型(G/T)内含子片段的重组pGL3-Basic载体,双荧光素酶活性检测发现pGL3-P2-G的荧光活性显著高于pGL3-P2-T(P0.05)。干扰预测的可能与目标SNP位点结合的转录因子RUNX2后,细胞晚期凋亡数量未发生显著变化(P0.05),但TENM3的蛋白和mRNA水平均显著降低(p0.05)。结果说明TENM3基因该SNP位点可以影响转录因子RUNX2的结合,且该转录因子可能具有抑制TENM3基因转录激活的作用。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28
【图文】：

果与预测值拟合良好，关联结果可靠。逡逑在ｇｒｏｕｐ邋１中，检测出两个显著ＳＮＰ位点（ｒｓ３１９７６７７５７，ｐ＝１．２４Ｅ－０６和逡逑＾３２０４９７３１１，口＝２．１９￡－０６）与己知基因４＾／／／重叠（图３－１八，８）；在奸0叩２中逡逑共检测出９个显著ＳＮＰ位点与己知兄Ｓ幻（ｒｓ３４５５４４９７８，ｐ＝６．９０Ｅ－０６；逡逑ｒｓ３４０９５９２５０，邋ｐ＝５．６０Ｅ－０６）邋，邋ＵＢＡＳＨ３Ａ邋（ｒｓ７０３８４９３３９，邋ｐ＝６．９０Ｅ－０６；邋ｒｓ３２７３８３８０２，逡逑ｐ＝６．９０Ｅ－０６；邋ｒｓ３４０５３２６５７，邋ｐ＝２．３３Ｅ－０６；邋ｒｓ３２９１９２９０９，邋ｐ＝８．９１Ｅ－０７）邋，邋ＰＴＰＮ２０Ｂ逡逑（ｒｓ６９１３４１３６５，邋ｐ＝７．７６Ｅ－０６）邋＞邋ＶＷＡ３Ｂ邋（ｒｓ３３１９３２５１８，邋ｐ＝２．５５Ｅ－０６）邋，邋ＮＵＡＫ１逡逑（ｒｓ３４４３１５０７８，邋ｐ＝１．３５Ｅ－０６）基因重叠，其中有６个ＳＮＰ位于１３号染色体上（图逡逑３－１（：，０）；在８１＇0叩３中检测到４个与已知基因７＾’添心（＾６９３３１２0５２，？＝２．２６￡－１１）、逡逑ＮＯＬ１０邋（邋ｒｓ３４３６９５９５２邋，邋ｐ＝４．６０Ｅ－０６；邋ｒｓ３３７９８８４５０邋，邋ｐ＝４．６０Ｅ－０６邋）邋，邋ＰＬＣＧ２逡逑（ｒｓ３３６８３９４５５

共检测到１６个在基因组水平上与猪腹股沟／阴囊疝显著相关的目标基因（表３－２）。逡逑在ｇｒｏｕｐ邋１中，共筛选到９个与腹股沟／阴囊疝显著关联的ＳＮＰ，但是并未定逡逑位到已知基因上（图３－２Ａ，Ｂ）；在ｇｒ0ｕｐ２中，检测到６个与阴囊疝显著关联的逡逑标记，并定位到逦（ｒｓ３４２３７０９３０，ｐ＝１．７１Ｅ－０７）、（ｒｓ３３１９３２５１８，逡逑ｐ＝５．６９Ｅ－０８）、／＾／ＣＣ￡（ｒｓ３２８６８１９４２，邋ｐ＝１．５３Ｅ－０９；邋ｒｓ３２９０７６４８１，ｐ＝ｌ．ｌｌＥ－０６）、．逡逑Ｍ７NBＯ邋（ｒｓ３４４３１５０７８，邋ｐ＝８＿ｌｌＥ－１０）和逦（ｒｓ３４０２３２８５７，ｐ＝３．５６Ｅ－０６）基因逡逑上。其中两个位点ｒｓ３２８６８１９４２邋（尸／？}：￡）和ｒｓ３４４３１５０７８逦与腹股沟／逡逑阴囊疝的关联达到极显著水平，同时两个ＳＮＰ位点ｒｓ３３１９３２５１８邋（ＷＨ３５）和逡逑ｒｓ３４４３１５０７８邋（）在阈值邋ｐ．ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝０．０１／Ｎ邋时同样关联显著（图邋３－２邋Ｃ，邋Ｄ）；逡逑在ｇｒｏｕｐ３中阈值为１Ｅ－０５和０．０１／Ｎ时筛选到的结果一致（图３－２邋Ｅ，Ｆ）。逡逑３４逡逑

对ＰＭＣ五基因包含该ＳＮＰ邋（ｒｓ３２８６８１９４２）的部分序列进行ＰＣＲ扩增，大逡逑小为４４１ｂｐ。并挑选出１０个不同样本的扩增产物混合测序，发现在ｒｓ３２８６８１９４２逡逑上存在一个Ｃ／Ｔ突变（图３－３邋Ａ）。并且这一突变可被限制性内切酶ｒ叫Ｉ识别，逡逑采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术，酶切后可产生三种基因型：ＴＴ基因型（４４１ｂｐ）、ＣＣ基逡逑因型（２２９ｂｐ／２１２ｂｐ）、Ｃ／Ｔ基因型（４４１ｂｐ／２２９ｂｐ／２１２ｂｐ），酶切琼脂糖电泳结果逡逑（图３－３邋Ｂ）所示。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ｍ２°°ｍ逦．邋＿２ｉ０＿邋■逦Ｍ邋１逦２逦３逦４逡逑ＧＧＧ邋ＡＣＣ邋Ｔ邋ｆ邋Ｇ邋ＡＴＣＴＴ逡逑逦Ｉ逡逑图３－３Ｐ／＾Ｃ￡基因ｒｓ３２８６８１９４２位点多态产物。Ａ：测序结果；Ｂ：琼脂糖凝胶电泳图逡逑Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ２０００；邋Ｃ／Ｔ：邋１；邋ＣＣ：邋２；邋ＴＴ：邋３，４逡逑Ｆｉｇ．邋３－３邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｒｓ３２８６８１９４２邋ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．邋Ａ：邋ｔｈｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ；邋Ｂ：邋ｔｈｅ逡逑ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｄａｔａ邋Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ邋２０００；邋Ｃ／Ｔ：邋１；邋ＣＣ：邋２；邋ＴＴ：邋３，４逡逑对基因的７＾１－ＲＦＬＰ位点，在１０９头法系大约克猪、５３头法系长白逡逑猪和３９头美系猪中进行基因型和基因频率分布的独立性检验

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本文编号：2746661