贵州省奶牛结核

发布时间：2020-07-09 15:17

【摘要】：奶牛结核病(Bovine tuberculosis,TB)和布鲁氏菌病(Bovine brucellosis)严重威胁着我国养牛业发展和人类公共卫生安全。2012年,国务院办公厅印发了《国家动物疫病防治中长期规划(2012-2020)》,将奶牛结核病和布鲁氏菌病列为二类动物疫病,且制定了奶牛结核病和布鲁氏菌病的综合防治措施。本研究根据《2017年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》(农医发[2017]7号)、《全国动物疫病专项流行病学调查实施方案》(农医防便函[2016]322号)、《国家奶牛结核病防治指导意见(2017-2020)》(农医发[2017]20号)和《国家布鲁氏菌病防治计划(2016-2020)》(农医发[2016]38号)规定的奶牛结核病和布鲁氏菌病调查方案,对贵州地区奶牛结核病和布鲁氏杆菌病感染情况展开调查,初步掌握了贵州省奶牛结核病和布鲁氏菌病感染情况;并建立快速、准确、可靠的牛结核病和布鲁氏菌病的二重PCR诊断方法;通过对牛奶营养安全和卫生安全的研究分析,并参照国家相关标准和规定,确定了安全评价体系的检测项目及指标,并建立可实施的安全性评价体系。以期为贵州省奶牛养殖,牛奶安全保障提供参考。1贵州省奶牛结核病和布鲁氏菌病感染情况调查为了解贵州省奶牛结核病的感染流行情况,2017-2018年间试验随机抽取贵州省9个州市的规模化奶牛养殖场共106场次,两年间采集抗凝血液样品20 478份进行牛结核γ-干扰素ELISA试验检测,检出阳性样品10份,个体阳性率为0.05%(10/20 478),其中2017年检出阳性样品7份,个体阳性率为0.07%(7/10 306),2018年检出阳性样品3份,个体阳性率0.03%(3/10 172)。可见,2018年较2017年阳性率有所下降;为调查布鲁氏菌病感染情况,2017-2018年间试验随机采集了全省9个州市的共106场次的奶牛全血样品27 435份,其中检出阳性样品6份,阳性率为0.02%(6/27 435),2017-2018年同一个场群连续检出阳性,2017年阳性群体为4个,2018年下降到了2个。调查结果表明,近年来贵州省关于奶牛结核病和布病的防控防疫措施收到一定成效,两种传染病的感染率呈下降趋势。2奶牛结核病和布鲁氏菌病二重PCR诊断方法的建立及应用参照NCBI中牛结核分枝杆菌pnc A(AF212297))、布鲁氏杆菌BM 21(AL27674)等基因序列,应用相关软件各设计了1对特异性引物,分别用于扩增牛结核分枝杆菌pnc A基因、布鲁氏杆菌BM 21基因的部分序列,扩增的目的片段大小为416 bp和282bp。用合作单位提供的阳性病料,通过对2种细菌单一PCR的退火温度和敏感性进行优化和检测,得到最佳退火温度分别为:牛结核分枝杆菌57℃、布鲁氏杆菌59℃,由敏感性得出最低检测量分别是:牛结核分枝杆菌68 pg、布鲁氏杆菌43 pg。再选择合适的二重PCR缓冲体系及酶,优化退火温度、模板及引物浓度,得出最佳反应体系为25μL,最佳退火温度为59℃;最后摸索二重PCR的特异性、敏感性,结果二重PCR中两种细菌的最低检测量分别为牛结核分枝杆菌68 pg、布鲁氏杆菌43 pg,证明试验建立的二重PCR检测方法具有敏感性高、特异性强等特点,本试验成功建立了一种能够同时且快速检测牛结核病和布鲁氏杆菌病的二重PCR检测方法。应用所建立的牛结核病和布鲁氏菌病二重PCR检测方法对2017-2019年4月间贵州部分地区的246份病料进行检测,二重PCR检测结果表明:246份病料中检出牛结核阳性1份,感染率为0.4%(1/246);检出布病阳性2份,感染率为0.81%(2/246);牛结核和布鲁氏菌病混合感染1份,混合感染率为0.4%(1/246);二重PCR与单一PCR的符合率均为100%。由此可见,奶牛结核病和布鲁氏菌病在贵州省牛群中存在且有混合感染的情况,试验建立的二重PCR检测方法对奶牛场单一或混合感染的快速诊断具有十分重要的意义。3牛奶安全性评价体系的建立及推广应用为确保牛奶的安全,本试验通过对贵州省奶牛养殖情况的调查,牛奶营养安全和卫生安全的分析及探讨,确定了本实验安全性评价体系需检测牛奶中是否含有牛结核分枝杆菌、布鲁氏杆菌;牛奶乳蛋白含量是否达标;铅、汞、磺胺类、氯霉素、三聚氰胺、黄曲霉素的含量是否超标。并参照国家和国际相关标准和规定,确定安全性评价体系所测项目的指标为:不得检出牛结核分枝杆菌和布鲁氏杆菌;不得检出氯霉素和三聚氰胺;乳蛋白含量不得低于2.8 g/100 g、铅含量不得高于0.05 mg/kg、汞含量不得高于0.01mg/kg、磺胺类残留不得超过0.10 mg/kg、黄曲霉素M1不得超过0.5 ug/kg,并建立可实施的评价体系。该方案首先采用本实验已建立的二重PCR检测方法检测牛结核和布病,再进行后续项目检测。为验证方案的可行性和实用性,本实验于2017-2019年4月间,从贵州省不同养殖场采集牛奶样品共2 123份,进行牛结核病和布病以及重金属铅、汞含量、磺胺类残留、三聚氰胺、黄曲霉素M1、氯霉素含量等检测,未检出铅、氯霉素、三聚氰胺不合格奶样,检出牛结核和布病不合格样品4份,乳蛋白含量不合格17份、磺胺类含量超标26份,黄曲霉素M1超标11份,将检测数据加以统计分析,得出针对贵州牛奶安全的建议指标。结果表明该安全性评价方案可以推广实施。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23
【图文】：

稀释度,抗原,阳性血清,滴度

图 2.1 虎红平板凝集试验Figure 2.1 Tiger red plate agglutination testSAT) 1:50、1:100、1:200、1:400，4 个稀释度，释度，本实验选用的稀释度为 1:50 和 1:100释到 1:50 和 1:100，抗原作 20 稀释并加入℃温箱 22-24 h 后，取出检查并记录结果。阳性血清和抗原对照:、阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血释到原有滴度，家抗原的方法与受检血清相

来源,样品,分析纯试剂,公司

图 3.1 样品来源及采集Figure 3.1 Sample Source and AcquisitionEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver19-T Vector等均购自大连宝生物工程有限公司（ Kit 试剂盒和E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit 质iowest 公司产品；乙醇等为国产分析纯试剂。器与耗材仪、Thermo Forma -80℃超低温冰箱和 Gel DOC公司；

退火温度,最佳反应条件,杆菌,体积

NA模板 4.0 μLTaq酶 1.0 μL体积 25.0 μL应条件的优化应的退火温度（55-60℃）进行优化，以确定最佳最佳反应条件为:枝杆菌最佳反应条件:in；94℃ 45 s，57.0℃ 45 s，72℃ 60 s，35cycle见图 3.2。菌最佳反应条件:min；94℃ 30s，59.0℃ 30 s，72℃ 60 s，35cycl见图 3.3。

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