单增李斯特菌表面蛋白基因lmo0159、lmo0160缺失株的构建及部分生物学特性研究

发布时间：2020-07-09 15:53

【摘要】：单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),是一种食源性致病菌,在自然界中广泛存在,常通过污染的食物感染人和动物。该菌为胞内寄生菌,可穿越宿主血脑屏障,肠道屏障及胎盘屏障,临床上引起腹泻、脑膜脑炎、败血症、新生儿溶血、肝炎及流产等症状,发病率及死亡率较高。LM细胞壁表面存在多种毒力蛋白,其中有一类至关重要的表面蛋白,其C-末端区含有LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly)保守基序,由分选酶Sort A识别共价结合到细胞壁肽聚糖上,呈现在细胞表面,发挥其毒力作用。根据LM EGD-e参考菌株的全基因组序列预测有41种LPXTG基序蛋白,其中Lmo0159和Lmo0160功能未知,本研究以李斯特菌病绵羊脑分离株LM90SB2为研究对象,对lmo0159、lmo0160基因进行克隆及生物信息学分析;利用同源重组技术分别构建LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160基因缺失株,分析其在环境耐受性、生物被膜形成能力及细胞水平和动物机体毒力的差异,以探讨lmo0159和lmo0160基因的功能,为进一步研究LM的致病机理奠定了基础。主要研究内容和结果如下:1.LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因克隆及序列分析:为了了解LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因编码蛋白的特征,利用PCR方法扩增lmo0159、lmo0160基因,分别连接pMD19-T载体,测序分析其特征。结果显示:lmo0159序列全长2 070bp,编码617个氨基酸;lmo0160序列全长为1 708bp,编码475个氨基酸;lmo0159、lmo0160基因核苷酸序列分别与不同来源4b型LM同源性均高达99%以上。Lmo0159蛋白是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白;Lmo0160蛋白为疏水性蛋白。两种蛋白均含有胶原蛋白结合域和Cna B功能域。本研究成功克隆LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因,并初步预测分析了目的基因部分生物学特征,为进一步研究LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因功能提供了理论依据。2.LM90SB2-(35)lmo0159、LM90SB2-(35)lmo0160缺失株的构建及鉴定:为研究lmo0159、lmo0160基因的功能,本试验利用PCR技术分别扩增lmo0159、lmo0160基因的上下游同源臂,SOE-PCR方法进行同源臂融合,获得(35)lmo0159、(35)lmo0160缺失片段,分别连接到pMD19-T载体,获得pMD19-T-(35)lmo0159、pMD19-T-(35)lmo0160,测序成功后,经双酶切并连接至pKSV7,获得重组穿梭质粒pKSV7-(35)lmo0159和pKSV7-(35)lmo0160,分别电转化到LM90SB2感受态细胞中,获得阳性转化子,置于含10μg/m L氯霉素BHI培养基中,42℃传代培养,获得LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160基因缺失株。再置37℃无抗性BHI培养基传代培养30代,PCR检测遗传稳定性,结果显示LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160基因缺失株构建成功,且遗传稳定。3.LM90SB2-(35)lmo0159、LM90SB2-(35)lmo0160缺失株环境适应性和生物被膜形成能力的研究:为探讨lmo0159和lmo0160基因缺失对LM环境适应性和生物被膜形成能力的影响。本试验测定了不同温度、pH、NaCl、乙醇胁迫环境下细菌生长情况及生物被膜形成能力。结果显示:在37℃和42℃培养条件下,LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160的生长低于LM90SB2;在0.5%和2.5%NaCl BHI中,LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160的生长低于LM90SB2;在3%和3.5%乙醇BHI中,LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160的生长低于LM90SB2;显微镜观察LM90SB2-(35)lmo0159和LM90SB2-(35)lmo0160形成生物被膜的交联密集度均低于LM90SB2;生物被膜定量分析发现,随着时间的延长,OD_(570)70 nm差异也增大,尤其在48h,差异均为极极显著(P?0.001)。结果表明,lmo0159和lmo0160基因的缺失降低了LM90SB2对环境的适应性和生物被膜形成能力。4.LM90SB2-(35)lmo0159、LM90SB2-(35)lmo0160缺失株毒力的研究:为探讨lmo0159和lmo0160基因缺失对LM毒力的影响。本试验分别用亲本株和缺失株对MBMEC、RAW264.7、SIEC和HBMEC细胞进行粘附、侵袭及细胞内增殖试验,及对小鼠腹腔感染后测定肝、脾、脑载菌量及小鼠存活时间。结果显示:LM90SB2-(35)lmo0159较LM90SB2,对SIEC及RAW264.7细胞的粘附率、侵袭率均降低,差异极显著(P?0.01);LM90SB2-(35)lmo0160较LM90SB2,对RAW264.7细胞的粘附率、侵袭率均降低,分别为差异极显著(P?0.01)与差异显著(P?0.05);缺失株对MBMEC、SIEC及HBMEC的胞内增殖量均降低;缺失株小鼠存活时间较亲本株均显著延长(P0.05);LM90SB2-?lmo0159和LM90SB2-?lmo0160对小鼠LD_(50)较LM90SB2分别下降了0.97和0.86个数量级;缺失株较亲本株,在肝和脾中的载菌量均降低。试验结果表明lmo0159和lmo0160基因缺失后均降低了LM90SB2的毒力。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

序列,基因,PCR扩增,转化子

单增李斯特菌表面蛋白基因 lmo0159、lmo0160 缺失株的构建及部分生物学特性研究果目的基因的扩增与克隆用特异性引物分别扩增 lmo0159 和 lmo0160 基因，PCR 产物经 10 g/L 琼脂糖检测，lmo0159 基因和 lmo0160 基因扩增产物分别在约 2 070 bp 和 1 708 bp 处带，与预期片段大小一致（图 1-2）。经克隆转化后，验证为阳性菌的质粒提海生工生物工程股份有限公司测序，经测序进一步验证，成功获得序列长为 2 lmo0159 基因阳性转化子和序列长为 1 708 bp 的 lmo0160 基因阳性转化子。

序列,基因,PCR扩增,转化子

菌株,比对分析,核苷酸,同源性

图 1-3 不同菌株 lmo0159 基因核苷酸和氨基酸序列与参考菌株同源性比对分析Fig.1-3 Homology analysis of nucleotide and amino acid sequences of lmo0159gene in various strains注: 右上角表示 lmo0159 基因核苷酸同源性, 左下角表示 Lmo0159 氨基酸同源性。Note: The right corner of lmo0159 nucleotide homology and the left corner of Lmo0159 amino acid homology.应用 MEGA 6.0 分析软件，绘制 lmo0159 基因编码序列进化树。LM90SB2 菌株lmo0159 基因序列与 4b 血清型菌株聚为同一支，之后与 4a 血清型菌株形成一大类群，说明它们亲缘关系比较近，而和 1/2a 血清型菌株形成另一个分支，亲缘关系较远（图1-4）。其遗传进化树与同源性分析相一致。

【参考文献】