黑龙江省家养黑熊三类肠道原虫分子流行病学调查及风险因素评估

发布时间：2020-07-09 16:31

【摘要】：毕氏微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi),芽囊原虫(Blastocystis spp.)和隐孢子虫(Cryptosporidium)是三种常见的人兽共患寄生性原虫。该些病原主要通过粪口途径传播,严重威胁动物与人类的健康。尽管国内关于毕氏微孢子虫,芽囊原虫和隐孢子虫的调查报道很多,但很少有关于黑熊感染这三种寄生虫的报道。为了明确黑龙江省家养黑熊毕氏微孢子虫,芽囊原虫和隐孢子虫的流行情况与基因型分布情况。本研究共采集312头黑熊的粪便样品,提取粪便基因组,通过扩增ITS,SSU r RNA和18S SSU r RNA基因序列确定黑龙江省家养黑熊毕氏微孢子虫,芽囊原虫和隐孢子虫感染情况,并鉴别毕氏微孢子虫和芽囊原虫的基因型。采用巢式PCR技术对黑龙江省家养黑熊毕氏微孢子虫的流行率及虫种/基因型和亚型进行鉴定,结果表明:黑龙江省家养黑熊毕氏微孢子虫感染率为4.8%(15/312;95%CI2.4-7.2)。雌性黑熊毕氏微孢子虫感染率为6.6%(9/136;95%CI 2.4-10.8),雄性黑熊毕氏微孢子虫感染率为3.4%(6/176;95%CI 0.7-6.1),雌性黑熊毕氏微孢子虫感染率高于雄性黑熊。幼年黑熊毕氏微孢子虫感染率为5.6%(10/180;95%CI 2.2-8.9),成年黑熊毕氏微孢子虫感染率为3.8%(5/132;95%CI 0.5-7.1),幼年黑熊毕氏微孢子虫感染率高于成年黑熊。室外饲养黑熊毕氏微孢子虫感染率为10.5%(6/57;95%CI 2.3-18.7),室内饲养黑熊毕氏微孢子虫感染率为3.5%(9/255;95%CI 1.2-5.8),室外黑熊毕氏微孢子虫感染率高于室内黑熊。用统计学软件(SPSS 16.0)对毕氏微孢子虫进行了风险因素的分析。在单个因素分析中,通过计算比值比(OR,odds ratio)及其95%CI(confidence interval),发现饲养位置(室外;P=0.033,P0.05;OR:3.216)会增大黑熊患毕氏微孢子虫病风险的可能。通过毕氏微孢子虫核糖体内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)的序列分析,从15个毕氏微孢子虫PCR阳性样本中鉴定出6个新基因型(CHB-1,CHB-2,CHB-3,CHB-4,CHB-5和CHB-6)。通过ITS序列的系统进化分析显示,本研究鉴定出的6个新基因型均位于具有人兽共患可能性的进化组Group 1中。本研究还应用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对所鉴定出的家养黑熊毕氏微孢子虫阳性DNA样本进行基因亚型鉴定。结果显示,共12个ITS基因型的分离株在2个位点(2个微卫星位点:MS3和MS7)测序成功,共检测出5种新的多位点基因型(MLG novel1-5),显示出黑熊源毕氏微孢子虫的遗传多样性。该研究结果表明ITS序列分析能力不足,而MLST分型方法可以弥补这个点。我们可以应用MLST分型方法来评估毕氏微孢子虫虫株人兽共患的可能性以及其传播途径播等问题。采用PCR技术对黑龙江家养黑熊芽囊原虫的流行率及虫种/基因型和亚型进行鉴定,结果表明:黑龙江家养黑熊芽囊原虫感染率为14.4%(45/312;95%CI 2.0-26.8)。雌性黑熊芽囊原虫的感染率为16.2%(22/136;95%CI 9.9-22.4),雄性黑熊芽囊原虫感染率为13.1%(23/176;95%CI 8.0-18.1),雌性黑熊芽囊原虫的感染率高于雄性黑熊。幼年黑熊芽囊原虫感染率为18.3%(33/180;95%CI 12.6-24.0),成年黑熊芽囊原虫感染率为9.1(12/132;95%CI 4.1-14.1),幼年黑熊芽囊原虫感染率高于成年黑熊。室外饲养黑熊芽囊原虫感染率为24.6(14/57;95%CI 13.6-37.3),室内黑熊芽囊原虫的感染率为12.2%(31/255;95%CI 8.1-16.2),室外黑熊芽囊原虫感染率高于室内黑熊。用统计学软件(SPSS 16.0)对芽囊原虫进行了风险因素的分析。在单个因素分析中,通过计算比值比(OR,odds ratio)及其95%CI(confidence interval),发现年龄(幼年,P=0.024;P0.05;OR:2.245)与饲养位置(室外;P=0.018,P0.05;OR:2.353)会增大黑熊患芽囊原虫病风险的可能。通过芽囊原虫SSU r RNA基因的序列分析证明,在45个PCR阳性样本中,共鉴定出一个基因型ST 1,通过系统进化分析发现该基因型存在人畜共患可能性。采用巢式PCR技术对黑龙江家养黑熊隐孢子虫的流行率及虫种/基因型和亚型进行鉴定。结果表明:黑龙江家养黑熊隐孢子虫感染率为0%(0/312)。综上所述,本研究首次对黑龙江地区家养黑熊三类肠道原虫进行调查,明确了黑龙江地区家养黑熊毕氏微孢子虫,芽囊原虫和隐孢子虫感染率,基因型或亚型及人兽共患风险性。运用更精确的MLST分型方法对我国黑龙江地区家养黑熊毕氏微孢子虫进行多位点序列分型,获得了毕氏微孢子虫的遗传学信息。研究结果为防控毕氏微孢子虫,芽囊原虫和隐孢子虫提供基础数据。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.93
【图文】：

本研究基于核糖体RNA基因的内部转录间隔区（ITS）的序列分析，对我国黑龙江地区所采集的312份黑熊粪便样本进行PCR扩增以鉴定毕氏微孢子基因型，鉴定结果见表3-1和图3-1，部分PCR阳性结果电泳图见图3-2。表3-1 黑龙江省家养黑熊毕氏微孢子虫的患病率Table 3-1 The prevalence of E. bieneusi in farmed black bear in Heilongjiang Province因素 分类 样品数 阳性数 感染率 95%置信区间 OR值 P值性别雄 176 6 3.4% 0.7-6.1 Reference 0.287雌 136 9 6.6% 2.4-10.8 1.776年龄幼年 180 10 5.6% 2.2-8.9 1.494 0.473成年 132 5 3.8% 0.5-7.1 Reference饲养位置室内 255 9 3.5% 1.2-5.8 Reference 0.033室外 57 6 10.5% 2.3-18.7 3.216图3-1 不同性别、年龄和位置的毕氏微孢子虫感染率（%）情况Fig. 3-1 The prevalence of the E. bieneusi in different region,gander and age.

201 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M图3-2 巢式PCR扩增毕氏微孢子虫结果Fig. 3-2 The nested-PCR products of E. bieneusi1：阳性对照；2-9：样本；10：阴性对照；M：marker1：positive control；2-9：sample；10：Negative control；M：marker由表3-1可以看出，黑龙江家养黑熊毕氏微孢子虫感染率为4.8%（15/312；95% CI2.4-7.2）。雌性黑熊毕氏微孢子虫感染率为6.6%（9/136；95% CI 2.4-10.8），雄性黑熊毕氏微孢子虫感染率为3.4%（6/176；95% CI 0.7-6.1），雌性黑熊毕氏微孢子虫感染率高于雄性黑熊。幼年黑熊毕氏微孢子虫感染率为5.6%（10/180；95% CI 2.2-8.9），成年黑熊毕氏微孢子虫感染率为3.8%（5/132；95% CI 0.5-7.1），幼年黑熊毕氏微孢子虫感染率高于成年黑熊。室外饲养黑熊毕氏微孢子虫感染率为10.5%（6/57；95% CI 2.3-18.7），室内饲养黑熊毕氏微孢子虫感染率为3.5%（9/255；95% CI 1.2-5.8），室外黑熊毕氏微孢子虫感染率高于室内黑熊。对家养黑熊的感染因素进行了二逻辑回归分析

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本文编号：2747707