1型鸭甲肝病毒纳米抗体的筛选与鉴定

发布时间：2020-07-10 12:10

【摘要】：1型鸭甲肝病毒(Duck Hepatitis A Virus Type 1,DHAV-1)临床上主要引起雏鸭急性肝炎,并具有高度致死性。VP1蛋白是DHAV-1主要衣壳蛋白,并诱导机体产生中和抗体。现有最灵敏特异的DHAV-1诊断方法主要是基于单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs),但mAbs制作成本高,很难大规模生产等因素,限制了其在相关领域的应用。为了寻找传统mAbs的替代抗体,本研究以商品化DHAV-1活疫苗为免疫原免疫双峰驼,成功构建了大小为6×10~6、插入率为96%的噬菌体展示免疫纳米抗体(Nanobody,Nb)库,以DHAV-1 VP1蛋白为抗原进行了三轮特异性纳米抗体筛选,成功筛选鉴定了一株DHAV-1纳米抗体。在此基础上,本研究成功鉴定了该纳米抗体的线性表位为~(174)PAPTST~(179),其在DHAV-1毒株之间高度保守,为特异灵敏检测DHAV-1提供了强有力的工具。本研究内容分主要分为以下三部分:1.全长DHAV-1 VP1蛋白的原核表达以DHAV-1传染性克隆为模板,利用PCR扩增VP1基因片段,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其分别克隆入pET-32a(+)和pGEX-6P-1原核表达载体,转化到Rosetta(DE3)表达菌株,37℃1mM IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定VP1-His和VP1-GST蛋白得到成功表达。2.DHAV-1VP1蛋白纳米抗体的筛选与鉴定以商品化DHAV-1活疫苗为免疫原免疫双峰驼,6次免疫过后,通过ELISA鉴定血清中DHAV-1特异性抗体滴度为1:50000。提取外周血淋巴细胞总RNA,通过RT-PCR得到cDNA,以cDNA为模板,经巢式PCR得到目的VHH基因,通过酶切位点连接到pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化雄性大肠杆菌TG1,成功构建了大小为6×10~6的噬菌体展示免疫纳米抗体库。以VP1-His为靶标,经过3轮富集筛选,成功筛选得到1株特异性针对DHAV-1 VP1的纳米抗体,命名为Nb25。3.Nb25抗原表位的鉴定首先将DHAV-1 VP1基因分五段,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点分别克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,转化到Rosetta(DE3)表达菌株,诱导表达后分段蛋白经Dot-blot鉴定,初步鉴定Nb25表位位于~(172)PLPAPTSTTS~(181)之间,然后将肽段~(172)PLPAPTSTTS~(181)分别从N端和C端缩进,将截短的6个肽段进行Dot-blot鉴定,经鉴定~(174)PAPTST~(179)为Nb25精确表位。经同源性对比,该表位在NCBI已发布DHAV-1毒株中高度保守,而在DHAV-2和DHAV-3存在变异。综上所述,本研究成功利用噬菌体展示技术筛选制备了针对DHAV-1的纳米抗体Nb25,并且Nb25具有高度特异性,只与DHAV-1病毒离子反应,与其他病毒不反应。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

基因,PCR扩增,酶切鉴定

图 3-1 VP1基因 PCR 扩增结果Fig.3-1 PCR product of VP1M: DNA Marker; 1. PCR product of VP1体酶切鉴定为 pET-VP1，pGEX-VP1，将 pET切，结果如图 3-2 所示。

酶切鉴定,重组质粒,载体,基因

图 3-1 VP1基因 PCR 扩增结果Fig.3-1 PCR product of VP1M: DNA Marker; 1. PCR product of VP1载体酶切鉴定名为 pET-VP1，pGEX-VP1，将 pET-V双酶切，结果如图 3-2 所示。

融合蛋白表达,情况,融合蛋白,蛋白

图 3-3 不同时间条件下 VP1-His融合蛋白表达情况M：蛋白 Marker；1. pET32a；2-6. VP1-His融合蛋白在 2h, 3h, 4h, 5h, 6h表达情况Fig.3-3 The expression of VP1-His fusion protein under different time conditionsM: Protein Marker;1. pET32a; 2-6. Induction time of 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, respectively.图 3-4 不同时间条件下 VP1-GST 融合蛋白表达情况

【参考文献】