高山被孢霉产EPA发酵工艺优化及其在蛋鸡饲料中的应用

发布时间：2020-07-10 17:09

【摘要】：二十碳五烯酸(EPA)是一种ω-3多不饱和脂肪酸,具有抗炎、抗癌、抗凝血、降血脂、防心血管疾病等多种生理功能。然而,EPA主要来源于深海鱼油,由于鱼类资源的有限、海洋环境的污染与提取工艺的复杂性,寻找可持续发展的EPA替代来源成为研究热点。其中,微生物油脂受到广泛关注并研究。产油微生物高山被孢霉油脂含量高、多不饱和脂肪酸(PUFAs)种类丰富,是经过FDA安全认证的用于生产花生四烯酸的工业化菌株。课题组前期通过过表达ω-3脂肪酸脱饱和酶PPD17获得重组菌株高山被孢霉CCFM698,实现了常温下将ARA转化为EPA的突破。为了进一步提高菌株的生产能力,本文进行了一系列的发酵工艺优化,并提出了一种基于溶氧与两阶段pH调控高山被孢霉高产EPA的补料发酵工艺。最后,将高山被孢霉作为PUFAs饲料添加剂应用于蛋鸡饲料中,考察其对鸡蛋与蛋鸡组织PUFAs组分的影响。主要研究结果如下:1.在摇瓶发酵基础上,确定了分批发酵的最适碳氮源添加比例为50 g/L葡萄糖与20 g/L豆粕。在7.5 L发酵罐实验中,分别针对发酵罐转速、富氧介质以及富氧空气等影响发酵体系溶氧的因素进行了考察。研究结果表明,发酵罐转速为400 r/min时可以防止剪应力过大对高山被孢霉菌体造成损伤,然而该转速条件无法满足菌体生长与脂质积累过程中的高溶氧需求。因此进一步对溶氧供给进行了研究,结果表明添加富氧介质4%正己烷可以提高发酵体系的溶氧,但正己烷不利于菌体生长与EPA的积累;而采用富氧空气策略维持发酵体系相对溶氧在30%左右可以有效满足溶氧需求,且EPA产量相比优化前提高了1.8倍。因此选择富氧空气策略作为发酵过程中的溶氧调控措施。2.由于富氧空气策略下糖耗速率剧增,分批发酵后期葡萄糖供应不足阻碍了脂质的合成与积累,因此进行了补料工艺研究。补料工艺研究结果表明,残糖反馈补料控制初始葡萄糖含量为30 g/L,通过间歇性补料维持残糖浓度在10~30 g/L,使得EPA的产量提高了79.1%。不同pH控制策略研究结果表明,氨水流加法能有效提高高山被孢霉的生物量和产脂水平,且高山被孢霉菌体生长的最适pH为6.0,脂质积累的最适pH为6.5。综上研究提出一种基于溶氧与两阶段pH调控高山被孢霉高产EPA的补料发酵工艺,最终菌体生物量可达41.2 g/L,总脂占菌干重31.6%,EPA产量高达3.5 g/L,该EPA产量为目前在高山被孢霉中的最高产量。3.通过蛋鸡实验研究高山被孢霉作为PUFAs饲料添加剂对鸡蛋与蛋鸡组织PUFAs组分的影响。研究结果表明随着高山被孢霉添加比例的增加,鸡蛋中的ARA、DPA与DHA含量逐步增加,ω-6/ω-3 PUFAs的比值逐渐下降,其中添加2%高山被孢霉在补充期末期时鸡蛋中的ARA、DPA与DHA含量分别提高21.1%、67.9%与68.9%,ω-6/ω-3PUFAs比值下降28.6%。另外,添加高山被孢霉可以显著降低蛋鸡组织的ω-6/ω-3 PUFAs的比值。其中添加2%高山被孢霉在补充期末期时鸡肝、鸡血、鸡胸肉中ω-6/ω-3 PUFAs比值分别下降46.5%、61.4%与73.7%。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6;TQ645.6;S816
【图文】：

溶氧,总脂,发酵过程,转速

3 结果与讨论知 400 r/min 条件下的相对溶氧在第 48 h 已降为 0，说明溶氧供给满足不了溶氧需求。与此相比 500 r/min 条件溶氧虽然略高一点，但是 500 r/min 转速过高造成剪应力损伤并在罐内中心产生旋涡，影响发酵液的均一性，且产生大量的泡沫容易导致染菌和溢罐因此，从成本上及实验控制等方面综合考虑适宜的转速条件为 400 r/min。Peng 等[49]在7.5L 发酵罐中研究分阶段转速控制对高山被孢霉 ME-1 产 ARA 的影响，在 0~96h 调节转速为 180 r/min，后切换为 100 r/min，最终相比转速一直为 180 r/min 条件 ARA 产量增加了 50.3%，结果说明高山被孢霉对剪应力的敏感性，脂质积累期可以通过降低转速来减少剪应力对菌体造成的损伤，从而促进脂质的合成。由于 400 r/min 不能满足整个发酵过程中的高溶氧需求，溶氧不足会阻碍菌体的生长及脂质的积累，因此有必要采取进一步的措施进行溶氧供给。

溶氧,总脂,正己烷,策略

江南大学硕士学位论文过程中提高溶氧最为常用的策略之一，但是由于丝状真菌对剪切力敏感，高转速对菌体造成损伤因此转速需要控制在适宜的范围内。在适宜转速条件下，通过在发酵体系中加入富氧介质增加发酵系统的溶氧系数或者通过通入富氧空气来提高溶氧供应是缓解微生物高氧需求的两种重要策略[54]。本研究利用重组菌株高山被孢霉 CCFM698 在常温下发酵生产 EPA，通过分批发酵优化选择出适宜的转速，在此基础上进一步研究添加 4正己烷与通入富氧空气的溶氧供给策略对发酵的影响，其中通入富氧空气策略维持体系相对溶氧在 30%左右可以缓解发酵过程中高溶氧需求的问题，且大幅度提高了高山被孢霉产 EPA 的能力，可以作为一种溶氧供给策略应用于丝状真菌高密度发酵过程。3.1.3.1 添加富氧载体 4%正己烷策略对高山被孢霉产 EPA 的影响研究由于在适宜的转速 400 r/min 条件下仍无法满足发酵过程中菌体生长以及脂质积累过程中的高溶氧需求，需要采取进一步的溶氧供给措施。该部分实验研究添加富氧载体4%正己烷策略对提高发酵体系的溶氧与产物积累的影响，其发酵检测数据如图 3-2 所示。

总脂,富氧空气,溶氧,生物量

22图 3-3 通入富氧空气策略对发酵过程中溶氧%(a)，生物量(b)，总脂(c)、EPA 产量(d)与残糖浓度(e)的影响Fig 3-3. The effects of dding oxygen-enriched air strategy on DO% (a), DCW (b), TFA (c), EPAproduction (d) and residual glucose concentration (e) during the fermentation process

【相似文献】