日本血吸虫ELAV-like 2的克

发布时间：2020-07-10 19:48

【摘要】：血吸虫病是由血吸虫感染引起的,严重危害人畜健康和经济发展的重大寄生虫病,至今仍是一个需要重视的公共卫生问题。日本血吸虫成熟雌虫所产虫卵是造成宿主病理损害及疾病再传播的根源,因此从控制雌虫生殖发育入手对控制血吸虫病的发生具有重要意义。本研究采用RT-PCR技术扩增SjELAV-like 2基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28(+)/SjELAV-like2,重组蛋白经纯化后制备了相应的多克隆抗体。结果表明,该基因长度为1894bp(登录号:MG515726),开放阅读框长度为1 635bp,共编码544个氨基酸,合并His-tag后分子量为64.2 kDa,与预期结果相符;Western blotting结果表明该蛋白具有良好的反应原性。荧光实时定量PCR分析发现,该基因在血吸虫童虫时期高表达,成熟后趋于稳定,且在雌虫体内的表达量显著高于同时期合抱雄虫:该基因在合抱后不同时期雄虫体内的表达量基本恒定,但正常合抱雄虫该基因的表达极显著高于单性感染雄虫。免疫组化研究发现,该蛋白主要定位于血吸虫虫体体被。通过体内RNAi实验成功筛选出干扰效果最佳的S1 dsRNA,并使用S1 dsRNA进行体内长期干扰试验。Real time RT-PCR结果显示,RNA干扰可明显抑制SjELAV-like2基因的表达。对长期干扰虫体产卵及卵胚孵化进行统计分析,结果表明,受干扰组宿主每克肝脏荷卵减少达46.02%(P0.01),虫卵的卵胚孵化减少达75.79%(P0.01),说明SjELAV-like 2基因对血吸虫产卵及虫卵孵化有重要影响。利用扫描电镜观察干扰组虫体及NC组虫体的体被表膜变化情况发现,SjELAV-like2siRNA干扰组虫体体被结构有明显改变,体被上泡状突出物明显增多。综上所述,本研究首次成功克隆、表达了SjELAV-like 2基因,分析了该基因在日本血吸虫不同时期、不同状态的表达情况,并通过RNAi实验初步研究了该基因沉默对血吸虫生长发育的影响,为今后进一步研究该基因对血吸虫雌虫生殖发育的影响及血吸虫疫苗候选分子的筛选奠定了基础。
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.735
【图文】：

序列,产物,血吸虫,基因

３Ａ邋ＳｊＥＬＡＶ－！ｉ＇ｋｅ邋２邋基因的免？查逡逑以曰本血吸虫成虫ｃＤＮＡ为模板，成功克隆出没如２基因完整ＯＲＦ逡逑序列（图１－１）逡逑ｂｐ逦Ｍ邋１逦２逡逑２０００邋￣逡逑１０００邋—Ｉ逡逑７５０邋—Ｐ逡逑５００——Ｂ逡逑２５０邋—Ｉ逡逑１００邋——■逡逑图１－１邋？ＳｊｆＴＵＫ－Ｍｅ邋２的ＰＣＲ扩增产物逡逑－１７－逡逑

产物,蛋白,蛋白抗原,切胶

转移至ＮＣ膜上，用小鼠抗ｒＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２蛋白的特异性血清作为一抗，Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测，结果发现有三条条带，将它们对应位置的蛋白进行质谱检测，结逡逑果表明仅特异性条带位置含有目的蛋白（图１－４），出现该现象可能是由于制备逡逑特异性血清的ｒＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２蛋白抗原由切胶法纯化而来，其中可能含有某些可逡逑刺激产生抗体的物质。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果表明ＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２具有良好的反应逡逑原性。逡逑－１９－逡逑

血吸虫,不同时期,全虫,日本血吸虫

——■■■■■■■Ｉ逡逑图１－４小鼠抗ｒＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２多抗与全虫蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析逡逑Ｍ：蛋白标准分子量；１：日本血吸虫全虫蛋白２：空白逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ａｎｔｉ－ｒＳｊＥＬＡＶ－ｌｉｋｅ邋２邋ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑Ｍ：邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｍａｓｓ邋ｍａｒｋｅｒ；邋ｌａｎｅ邋１邋：邋ｓｏｌｕｂｌｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ邋ｊａｐｏｎｉｃｕｍ邋２邋：邋ｂｌａｎｋ逡逑３．４不同时期血吸虫基因的扩增逡逑以１８、２５、２８、３５、４２ｄ日本血吸虫ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增没ＡＬＡＷ／知逡逑２基因，电泳结果显示不同时期ｃＤＮＡ扩增产物大小相同（图１－５），将ＰＣＲ产逡逑物连接到Ｔ－克隆载体，对阳性克隆的测序分析也说明不同时期ｃＤＮＡ扩增的逡逑没２基因产物相同，表明该基因在血吸虫体内转录时剪切方式一致。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１邋２邋３邋４邋５逡逑２０００——■逡逑１０００——■逡逑７５０——Ｉ逡逑５００——■逡逑２５０——Ｉ逡逑１００——■逡逑图１－５不同时期血吸虫没２基因的ＰＣＲ扩增逡逑－２０－逡逑

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