我国啮齿目动物携带的指环病毒基因组学特征分析

发布时间：2020-07-10 20:56

【摘要】：近年来新发传染病屡有发生,全球近75%的新发传染病是动物源性的。啮齿目动物作为全球种类最多、分布最广的哺乳动物种群,它们与人类密切接触,是各种新发病毒的自然储库,可传播60多种已知的人畜共患传染病。因此我们对我国啮齿目动物携带的病毒组进行了大规模系统性的研究,该课题作为啮齿目动物病毒组研究的一部分聚焦于指环病毒。由于缺乏有效的细胞系模型和合适的动物模型来支持病毒复制研究,指环病毒的致病性仍然存在争议,但是目前其中的一些基因型被认为具有致病能力。近年来指环病毒已相继从人类及其他哺乳动物中检出。啮齿类动物指环病毒之前已在英国报道过,然而目前国内没有关于啮齿动物携带指环病毒的报道,因此对于了解不同地区的多种啮齿目动物的指环病毒的存在情况是十分必要的。在本研究中,我们利用宏基因组学研究方法,对我国20个代表性省份的5个科的42种啮齿目动物,共计2416份咽拭子和肛拭子样品的指环病毒的存在情况进行检测,结果显示几乎所有的啮齿目动物都携带有指环病毒,扩充了啮齿目动物携带指环病毒的宿主种类。根据高通量测序结果提示,结合巢式PCR方法对原始样本中的指环病毒基因序列进行了进一步验证,并根据序列相似性选择具有代表性的序列进行全基因扩增,最终得到了 11个代表性的全基因组和2个部分基因组序列信息。我们获得的啮齿目动物指环病毒基因组长度约有2.3kb-2.6kb。根据序列拼接和基因注释结果,本研究获得的指环病毒基因组包含2-3个开放阅读框,此外还包括一个495-868bp的非编码区。通过进一步对13个指环病毒ORF1的进化分析,啮齿类动物指环病毒形成了 4个谱系(1-4),根据序列同源性、系统进化及基因组结构等分析结果,建议其与英国的啮齿目动物指环病毒构成3个新的病毒属,这些新发现的指环病毒扩展了病毒学的分类。本研究表明鼠科的小家鼠携带啮齿目动物指环病毒毒株RtMm-AneV/ZJ2016,这提示同一种属的实验室小鼠也可能被该毒株感染而用于研究指环病毒的复制周期和致病性。本研究中概述了啮齿目动物指环病毒并鉴定出中国啮齿目动物携带的13种新型指环病毒。这些数据可以为识别和追踪啮齿目动物携带潜在的指环病毒提供重要的科学依据。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

具有很高的人畜共患风险。在城市郊区，啮齿目动物作为连接人类和野生动物的媒逡逑介，在这些自然生态系统中，人类往往暴露于一些人畜共患病病原的自然疫源地中。逡逑啮齿目动物传播传染病的途径分成直接传播和间接传播两种（图１）。直接传播途逡逑径是啮齿目动物通过多种方式直接将病毒传播给人类，包括抓咬人、人食入被啮齿逡逑目动物粪便污染的食物或水以及吸入其粪便、尿等污染物所形成的气溶胶颗粒；间逡逑接传播途径是啮齿目动物通过体外寄生的节肢动物如蜱、圣、螨等媒介动物间接将逡逑病毒传播给人类。在这种传播方式中，啮齿目动物主要作为储存宿主，通过媒介动逡逑６逡逑

编码区组成，该编码区含有至少三个开放阅读框（ＯＲＦ）和约１．２ｋｂ（ＴＴＳｕＶ中０．８ｋｂ）逡逑的非翻译区（ＵＴＲ），其富含ＧＣ区域［３７］。高度保守的ＵＴＲ区域含有ＴＡＴＡ盒和ｐｏｌｙＡ逡逑尾部序列，它被用作转录因子，依赖于不同的细胞系呈现出不同的转录活性（图２）。逡逑含有ＴＴＶ完整基因组构建体的质粒在ＣＯＳ１细胞中转录成信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ），然后逡逑得到了三个不同长度的信使ＲＮＡ分别为３．０ｋｂ，１．２ｋｂ和ｌ．Ｏｋｂ。这三个转录产物起逡逑始于ＴＡＴＡ框附近的同一个区域，也使用相同的编码区末端的Ｐｏｌｙ（Ａ）信号。所有的逡逑转录产物使用相同的剪切位点形成信使ＲＮＡ，只有３．０ｋｂ的ｍＲＮＡ具有完整的逡逑ＯＲＦ１，１．２ｋｂ和ｌ．Ｏｋｂ的ｉｎＲＮＡ发生了二次剪切，将ＯＲＦ２与同一个阅读框内的逡逑ＯＲＦ４连接到一起［２９］。０１１？１编码的约７００－７７０个氨基酸的蛋白质被认为是病毒衣壳逡逑蛋白［１６］。ＯＲＦ２编码约２００个氨基酸的蛋白质，在一些基因型中，它被分成更小的逡逑ＯＲＦ２ａ和ＯＲＦ２ｂ，后者含有类似于蛋白酪氨酸磷酸酶的ＣＡＶ－ｌｉｋｅ保守氨基酸基序，逡逑其可能参与自然感染期间细胞和／或病毒蛋白质调控和处理［３８］。ＯＲＦ３的产物是２８５逡逑个氨基酸的蛋白质

实为８９个不同地区不同鼠种的混合样品）。混合后的样本利用Ｈｉｓｅｑ２５００测序平台逡逑进行测序，样品经“过滤－富集－核酸酶消化－病毒核酸提取”策略后，进行反转录及ＰＣＲ逡逑扩增构建ｃＤＮＡ文库，部分样本的跑胶结果如图３．２所示，我们切取５００－１０００ｂｐ的逡逑片段，Ｑｕｂｉｔ邋定量大于邋２０ｎｇ／ｎｌ，ＮａｎｏＤｒｏｐ邋定量邋ＯＤ２６０／２８０邋为邋１．８－２．０，邋ＯＤ２６０／２３０逡逑为２．２－２．３，符合上机要求，产物很纯，无蛋白、酚类等有机物的污染。然后用Ｂｉｏｍｐｔｏｒ逡逑进行片段化，设置频率Ｈ，打３０ｓ，间隔ｌｍｉｎ，每隔１５ｍｉｎ换一次薄冰水，将打断逡逑管中液体离心后再次进行打断，共反复进行４次，即打断１小时。为保证ｃＤＮＡ文逡逑库已经片段化且可以进行后续步骤，需进行２１００邋Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析，按标准操作流逡逑程，完成ｃＤＮＡ文库末端修复、加Ａ、加接头等步骤后需再一次进行２１００邋Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ逡逑分析。图３．３－３．４为ｃＤＮＡ文库进行的上机测序前２１００邋Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ定性定量部分结逡逑果。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋Ｆｉｌｅ邋Ｒｕｎ邋Ｓｕｍｍａｒｙ为混合样品电泳图。下方为每个混合样品的逡逑２１００分析结果，横坐标为测序片段长度分布，纵坐标为测序片段峰度大小。逡逑Ｍ邋样本１样本２邋Ｎ逡逑２０００逡逑７５０邋Ｃ３逡逑２５０逡逑１００逡逑图３．２邋ｃＤＮＡ产物电泳结果。Ｍ：邋Ｍａｒ

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本文编号：2749438