Survivin在不同年龄牦牛组织器官内表达检测及其多克隆抗体的制备
发布时间：2020-07-10 21:03
【摘要】：研究目的 牦牛是高原特有物种,依据其自身的解剖学和生理学特性能够很好地适应高原的特殊环境。存活素(Survivin)作为凋亡抑制蛋白(IAP)家族最小成员既能参与细胞的增殖分化也能参与细胞的凋亡代谢。Caspase-3作为凋亡信号通路的关键因子对疾病和细胞凋亡起着重要的调节作用。本文通过研究survivin生物信息学特性,及其在新生和成年健康牦牛各组织器官中的表达差异,并分析survivin和caspase-3在三个年龄组免疫器官的基因和蛋白表达水平及特异性定位,为进一步研究survivin对牦牛不同组织器官,尤其是机体免疫功能的调控机理提供重要的理论依据。此外,本文通过构建survivin重组质粒,诱导表达重组蛋白,并制备良好的兔源多克隆抗体。为进一步开展牦牛survivin相关研究及牦牛机体其他因子抗体的制备奠定试验基础。材料与方法1.试验材料:健康牦牛(新生组,2-5日龄,n=5;半岁组,5-7月龄,n=5;成年组,3-4岁,n=5)组织器官(心脏,肝脏,肺脏,大脑,肾脏,睾丸,脾脏,淋巴结及胸腺),成年大耳白兔,n=4。2.试验方法:(1)采用RT-PCR方法克隆牦牛survivin编码区基因,利用生物信息学软件及官方网站对目的基因进行生物信息学分析。(2)采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学(IHC)方法对survivin在新生和成年组牦牛不同组织器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑和睾丸)中的基因、蛋白水平和阳性定位情况进行分析。并用SPSS21.0软件的单因素方差分析法对survivin基因和蛋白的表达量进行差异性分析。(3)采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法对survivin和caspase-3在新生、半岁及成年组牦牛免疫器官(脾脏、胸腺和淋巴结)中的基因、蛋白水平及定位情况进行分析。并用SPSS21.0软件的单因素方差分析法对survivin和caspase-3基因及蛋白的表达量进行差异性分析。(4)采用大肠杆菌表达系统对克隆的重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定重组蛋白。将纯化重组蛋白免疫健康成年大耳白兔制备多克隆抗体,用Western blot、间接ELISA技术及免疫组织化学技术鉴定多克隆抗体。结果 1.成功克隆了牦牛survivin编码区基因(GenBank:KX121425.1),survivin基因编码的蛋白质含有103个氨基酸,分子量为11.8374 kDa,理论等电点为5.325pI,存在12个磷酸化位点;且为可溶性,非跨膜蛋白;根据克隆基因序列预测出了survivin的二级和三级结构。以上结论说明,survivin在进化中既具有高度保守性,也存在种属特异性。2.Survivin在新生及成年组牦牛各组织器官中均有表达,在相同器官中,survivin的表达水平成年组高于新生组。在相同年龄组中,survivin在牦牛心脏和肝脏中始终处于相对高水平表达。免疫组织化学结果显示,survivin阳性表达主要集中在细胞质中。新生组survivin主要定位在心脏的心肌细胞,肝脏的肝细胞,脾脏的红髓,肺脏的各级支气管,肾脏的近端小管和远端小管(近端小管的阳性表达强于远端小管),大脑的神经纤维及睾丸的肌样细胞。与新生组相比,成年组的survivin阳性定位具有一定的差异性:成年组肺部survivin除了在各级支气管有表达,还在肺泡上皮细胞有表达;成年组survivin主要定位在各级生精细胞及睾丸间质细胞中。3.在新生、半岁及成年组牦牛免疫器官中的表达结果显示,相同年龄组,survivin在脾脏中的表达最高,胸腺次之,淋巴结最低,其中survivin基因在脾脏的表达水平和survivin蛋白在淋巴结表达水平分别呈极显著差异(P0.01);相同器官,survivin的表达水平随年龄增长呈下调趋势,且差异极显著(P0.01)。而caspase-3的表达水平与survivin大致呈相反趋势。此外,牦牛三个年龄组免疫器官中survivin和caspase-3的阳性定位一致,主要分布在淋巴结的髓质,胸腺的胸腺小体及脾脏的红髓和边缘区。4.成功构建原核表达重组质粒,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,目的蛋白约为16.5 kDa,且以包涵体形式存在;纯化蛋白经Western blot分析鉴定,能与阳性血清特异性结合,说明具有较好的反应原性;重组表达蛋白免疫大耳白兔后分离的血清经Western blot分析能与重组蛋白特异性结合,说明重组蛋白能够诱导机体产生相应抗体,具有较好的免疫原性。间接ELISA数据表明制备的多克隆抗体具有良好的抗体效价。制备的多克隆抗体能够用于免疫组织化学试验。结论1.本文通过分析牦牛survivin编码区核苷酸序列生物信息学特性,说明牦牛survivin基因在生物进化过程中的高度保守性及种属特异性。2.本文通过检测survivin在新生和成年牦牛不同器官的表达和定位情况,说明survivin可能参与牦牛各组织器的功能调节。为进一步研究survivin对牦牛不同组织器官生理功能的调控机理提供重要的理论依据。3.本文通过检测survivin和caspase-3在不同年龄牦牛免疫器官的表达和定位情况,说明survivin可能在caspase-3参与的凋亡通路上参与免疫器官适应性以减缓牦牛免疫器官的衰老进度。为进一步研究survivin对牦牛机体免疫功能的调控机理提供重要的理论依据。4.本文通过构建牦牛survivin重组质粒,诱导表达重组蛋白,制备的兔源多克隆抗体能够用于免疫组织化学、Western blot及间接ELISA试验。为牦牛机体其他因子抗体的制备奠定试验基础,也为以后开展牦牛survivin相关研究提供理论基础。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.85;Q78
【图文】：
结果表明牦牛与瘤牛和黄牛survivin基因的亲缘关系最近，与人类survivin 基因的亲缘关系最远（表 3 ）。利用软件 MEGA6 中的临位相连法（Neighbor-Joining）绘制出了survivin基因的系统进化树（图1），系统进化树也表明牦牛survivin基因与瘤牛和黄牛的进化水平较为相近，与人类的较远。表3 牦牛和其他物种之间survivin基因核苷酸序列同源性比较Table 3 Homologous comparisons of yak survivin gene with that of other species物种 GenBank序列号 核苷酸序列同源性（%）Species GenBank ID Nucleotide sequence homology（%）瘤牛（Bos indicus） XM_019982459.1 99黄牛（Bos taurus） NM_001001855.3 99绵羊（Ovis aries musimon） XM_012109576.2 98藏羚羊（Pantholops hodgsonii） XM_005958602.1 98山羊（Capra hircus） XM_005694094.3 96野猪（Sus scrofa） NM_214141.1 96马（Equus caballus） XM_001915400.4 93犬（Canis lupus familiaris） NM_001003348.1 93双峰驼（Camelus dromedarius） XM_010983810.1 92人（Homo sapiens） HM625836.1 90
2.1.3 牦牛 survivin 基因编码蛋白亲疏水性和跨膜结构分析根据在线软件Protscale分析牦牛survivin基因氨基酸序列的亲疏水性结果表明（图2）：survivin氨基酸序列第5位甘氨酸Gly预测的分值最高为1.500，其疏水性最强；第82位天冬酰胺Asn预测的分值最低为-3.322，其亲水性最强。牦牛survivin基因编码的整个氨基酸序列中亲水性氨基酸大于疏水性氨基酸，表明survivin编码蛋白为可溶性蛋白。根据在线软件TMHMM Server V 2.0 分析发现survivin蛋白无跨膜螺旋，为非跨膜蛋白。
图 3 牦牛survivin 氨基酸潜在磷酸化位点分析。临界阈：紫色线条；丝氨酸：红色线条；苏氨酸：绿色线条；酪氨酸：蓝色线条。当线条高度超过临界阈时代表该位点为潜在磷酸化位点。Figure 3 Potential phosphorylation site analyses of yak survivin. Threshold: purple lines;Serine: red lines; Threonine: green lines; Tyrosine: blue lines. If the line height exceeds thethreshold, it is the potential phosphorylation site.2.1.5 牦牛 survivin 基因编码蛋白结构预测分别利用在线软件IBCP和PHYRE2对survivin蛋白质二级结构和三级结构进行预测（图4）。结果发现，编码survivin蛋白的103个氨基酸根据二级结构的不同分成了三部分，其中41个氨基酸构成了该蛋白的α-螺旋区，占总蛋白的39.81%；20个氨基酸构成了该蛋白的延伸链区，占总蛋白的19.42%；无规则卷曲由42个氨基酸组成，占总蛋白的40.77%。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.85;Q78
【图文】：
结果表明牦牛与瘤牛和黄牛survivin基因的亲缘关系最近，与人类survivin 基因的亲缘关系最远（表 3 ）。利用软件 MEGA6 中的临位相连法（Neighbor-Joining）绘制出了survivin基因的系统进化树（图1），系统进化树也表明牦牛survivin基因与瘤牛和黄牛的进化水平较为相近，与人类的较远。表3 牦牛和其他物种之间survivin基因核苷酸序列同源性比较Table 3 Homologous comparisons of yak survivin gene with that of other species物种 GenBank序列号 核苷酸序列同源性（%）Species GenBank ID Nucleotide sequence homology（%）瘤牛（Bos indicus） XM_019982459.1 99黄牛（Bos taurus） NM_001001855.3 99绵羊（Ovis aries musimon） XM_012109576.2 98藏羚羊（Pantholops hodgsonii） XM_005958602.1 98山羊（Capra hircus） XM_005694094.3 96野猪（Sus scrofa） NM_214141.1 96马（Equus caballus） XM_001915400.4 93犬（Canis lupus familiaris） NM_001003348.1 93双峰驼（Camelus dromedarius） XM_010983810.1 92人（Homo sapiens） HM625836.1 90
2.1.3 牦牛 survivin 基因编码蛋白亲疏水性和跨膜结构分析根据在线软件Protscale分析牦牛survivin基因氨基酸序列的亲疏水性结果表明（图2）：survivin氨基酸序列第5位甘氨酸Gly预测的分值最高为1.500，其疏水性最强；第82位天冬酰胺Asn预测的分值最低为-3.322，其亲水性最强。牦牛survivin基因编码的整个氨基酸序列中亲水性氨基酸大于疏水性氨基酸，表明survivin编码蛋白为可溶性蛋白。根据在线软件TMHMM Server V 2.0 分析发现survivin蛋白无跨膜螺旋，为非跨膜蛋白。
图 3 牦牛survivin 氨基酸潜在磷酸化位点分析。临界阈：紫色线条；丝氨酸：红色线条；苏氨酸：绿色线条；酪氨酸：蓝色线条。当线条高度超过临界阈时代表该位点为潜在磷酸化位点。Figure 3 Potential phosphorylation site analyses of yak survivin. Threshold: purple lines;Serine: red lines; Threonine: green lines; Tyrosine: blue lines. If the line height exceeds thethreshold, it is the potential phosphorylation site.2.1.5 牦牛 survivin 基因编码蛋白结构预测分别利用在线软件IBCP和PHYRE2对survivin蛋白质二级结构和三级结构进行预测（图4）。结果发现，编码survivin蛋白的103个氨基酸根据二级结构的不同分成了三部分，其中41个氨基酸构成了该蛋白的α-螺旋区，占总蛋白的39.81%；20个氨基酸构成了该蛋白的延伸链区，占总蛋白的19.42%；无规则卷曲由42个氨基酸组成，占总蛋白的40.77%。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 樊美荣;徐建军;张o
本文编号：2749446
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2749446.html
