辽宁地区猪源乙型脑炎病毒血清学调查及主要基因遗传变异分析

发布时间：2020-07-11 06:24

【摘要】：背景:乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)主要分布在东南亚与太平洋西部地区,每年约有数万人感染乙型脑炎病毒,病死率在25%左右。乙型脑炎是以三带喙库蚊为主要传播媒介,严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。猪是乙型脑炎病毒的重要贮存宿主和增殖宿主,也是乙型脑炎的主要传染源。乙型脑炎可引起妊娠母猪流产、产死胎或木乃伊胎等繁殖障碍,也可引起公猪急性睾丸炎或不育,疾病通常在“蚊-猪-蚊”等动物间循环。辽宁省猪源乙型脑炎相关方面的研究还不够深入,因此有必要开展猪源乙型脑炎病毒血清学检测以及分子生物学的研究。目的:本研究主要通过血清学检测了解辽宁省部分地区乙型脑炎病毒在宿主动物猪体内的感染情况,通过对猪乙型脑炎病毒的分离鉴定,解析我省猪源乙型脑炎病毒毒株的基因型以及主要基因变异和遗传进化,为进一步防控猪群和人的乙型脑炎提供一定理论基础和技术支撑。方法:采集猪血清样本,酶联免疫吸附试验(ELISA)进行乙型脑炎病毒血清IgG抗体检测,检测抗体阴性的猪血清样本进行细胞培养(抗体阳性说明机体已感染,感染后病毒被抑制中和,不能再分离出病毒),从病变的细胞中提取病毒RNA,并采用猪乙型脑炎病毒特异性引物进行RT-PCR鉴定,对阳性PCR产物进行基因测序,测序结果与Genbank中乙型脑炎病毒相关参考株基因进行比对分析,并构建乙型脑炎病毒遗传进化树。结果:1、2018年,在辽宁省部分地区共采集347份猪血清样本进行乙型脑炎病毒血清IgG抗体检测,结果乙型脑炎病毒血清IgG抗体阳性数为195份,阳性率为56.2%,为确定猪群乙型脑炎病毒感染情况提供了数据基础。2、在152份猪血清乙型脑炎病毒IgG抗体阴性样本中分离出一株GⅠ型乙型脑炎病毒,将经RT-PCR鉴定乙型脑炎病毒获得的产物进行基因测序,用DNAStar等生物学软件分析表明,该分离株与Genbank中国内外乙型脑炎病毒代表毒株E基因的核苷酸同源性在77.3%-99.3%之间,氨基酸同源性在91.0%-99.8%之间,其中与疫苗株SA14-14-2的E基因核苷酸序列同源性为87.8%,编码的氨基酸同源性为97.2%。该毒株与疫苗株SA14-14-2的E基因编码Domain区有13个氨基酸位点发生变异,Domain区段外有1个氨基酸位点变异。这是我省首次从猪血中分离到乙型脑炎病毒,为宿主动物猪源乙型脑炎病毒分子生物学特性研究奠定了基础,有利于研发乙型脑炎疫苗,保障人畜健康,提高养猪业经济效益。结论:辽宁省猪群乙型脑炎感染率较高,应加强猪群的血清学检测,以便及时掌握猪群乙型脑炎感染情况。分离到的GⅠ型乙型脑炎病毒与疫苗株SA14-14-2的E基因相比共有14个氨基酸位点变异,提示该次分离到的猪源乙型脑炎病毒分离株部分核苷酸发生变异,该结果为研究乙型脑炎病毒的分子生物学特性,以及防止乙型脑炎的发生与流行,保证人畜健康,促进公共卫生安全有着重要意义。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28
【图文】：

乙型脑炎病毒,传染源,传播媒介,乙型脑炎

沈阳农业大学硕士学位论文表现为轻型感染或隐性感染，只有少数人感染后引起中枢神经系统症状，发生脑常以10岁以下的儿童和60岁以上的老年人发病较多，这可能是由于儿童的自身免发育不完善，老年人大多数没有进行免疫接种和自身免疫力较低引起的（杨芳等因儿童计划免疫的实施，降低了儿童乙型脑炎的发病率。目前乙型脑炎发病多为这部分人群多生活在农村或者城乡结合部且居住环境卫生状况较差，预防意识薄加了乙型脑炎发病的风险（朱冉与胡泊，2017）。

结构图,乙型脑炎病毒,结构图

成熟的M蛋白是在病毒粒子成熟的过程中由prM切割而来（吕顺燕等，2017；2017），对维持E蛋白结构有必要作用（Liu X Y et al，2019）。糖基化包膜蛋白蛋白（M）形成二十面体衣壳嵌入在磷脂双分子层。E蛋白是较大的结构蛋白（ al，2016），得到广泛的研究，由500个氨基酸残基组成，具有两个潜在的糖基分子量为53kD（祖立闯等，2010）。E蛋白是乙型脑炎病毒主要的囊膜蛋白（Ml，2018），参与许多重要的生物学过程，包括病毒粒子的组装、吸附、致病、膜宿主的免疫应答、血凝和病毒中和等过程（Barnali Natha et al，2017）。E蛋白簇包括三个结构域，分别是结构域Ⅰ（DomainⅠ）、结构域Ⅱ（DomainⅡ）和结构omainⅢ）（Fan J et al，2013），其中结构域Ⅰ含有糖基化位点和生物活性的抗原1-51位、E137-196位和E293-311位共计128个不连续的氨基酸残基组成，结构域凝抗原活性的表位，由E52-136位和E197-292位共计171个不连续的氨基酸残而结构域Ⅲ包含了乙型脑炎病毒主要的特异性表位，与受体结合有关（Han N5），能够介导病毒与细胞的膜融合，由E310-411位共计100个连续的氨基酸残基e F F et al，2008；Lei Y et al，2018）。E蛋白能刺激机体产生血凝抑制抗体和中Brian Nickols et al，2017），可作为RT-PCR检测的材料。

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沈阳农业大学硕士学位论文猪血清接种白纹伊蚊卵细胞系（C6/36）后，在 72h 开始出现细胞病变，接毒的单层细胞折光性增强，少数细胞聚集成丛，突出于单层细胞表面，96-120h 细胞病变更为明显细胞脱落、聚集、圆缩，可达 75%以上，脱落的细胞漂浮于培养液中。如下图所示显微镜（×100）下正常的 C6/36 细胞和接毒后病变的 C6/36 细胞对照比较。

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