猪圆环病毒2型新型疫苗的研制及中和抗体快速检测方法的建立

发布时间：2020-07-11 16:36

【摘要】：猪圆环病毒2型(PCV2)感染导致多种猪圆环病毒2型相关疾病(PCVAD),给全球养猪业造成巨大的经济损失。疫苗接种是预防PCVAD最经济有效的方法。随着免疫压力的加大,PCV2病毒在快速进化,而现有商业化PCV2疫苗的疫苗株均是PCV2a或者PCV2b基因型,其对临床占主导地位的PCV2d毒株的防控效果存有争议。因此研发广谱、高效的PCV2新型疫苗尤为重要。本研究从猪圆环病毒2型流行病学调查、新型疫苗研制以及疫苗效果快速评估方法的建立等方面入手,以期为PCVAD的防控提供必要工具。获得的结果如下:1.于2016-2018年间从全国65家猪场的217份临床样本中,分离获得48株PCV2毒株,测定其基因组序列并进行PCV2遗传变异与进化分析。48株PCV2毒株中PCV2a、PCV2b与PCV2d占比分别为4/48、13/48和31/48。其中,PCV2d亚型在2016年、2017年和2018年占比分别为54.5%、65.2%和71.4%,表明PCV2d亚型在我国逐年增加,并占有优势地位。48株PCV2毒株的基因序列同源性为93.4%-100%。RDP 4.0软件分析分离的48株PCV2毒株,未见重组事件。PCV2d的主要抗原表位(~(43)D/G、~(115)D/G、~(134)N/T、~(165)P/T、~(169)G/R/S、~(210)E/G/D)存在较高的氨基酸残基多样性。仔猪攻毒PCV2d HeB-1株后14、21d血清中病毒滴度均高于PCV2b LN-3株,但差异不显著(p0.05)。攻毒仔猪的腹股沟淋巴结中PCV2抗原的含量在PCV2d HeB-1株和PCV2b LN-3株之间无明显差异。2.将PCV2 HeB-1株的ORF2基因与分子佐剂—补体C3d-P28进行融合,开发出一种新型PCV2 DNA疫苗(pVOC3)。pVOC3疫苗免疫仔猪后攻毒,可显著减少仔猪血清中PCV2b或PCV2d的病毒拷贝数,产生较高的PCV2特异性抗体,并刺激PCV2特异性干扰素γ分泌细胞的产生,与未加C3d-P28佐剂的试验组(pVO)差异显著(p0.05)。3.利用马赛克T-细胞疫苗设计软件获得PCV2病毒的马赛克Cap蛋白,其对66条参考PCV2 Cap蛋白具有较好的表位覆盖,与PCV2 HeB-1株、PCV2 LN-3株和PCV2LG株的同源性分别为98.3%、97.0%、91.8%。马赛克Cap蛋白诱骗表位(169-180aa)用Pan DR T辅助细胞表位替换,获得一个改构马赛克Cap蛋白。以PCV2 HeB-1基因组为骨架,将其Cap蛋白基因用优化的改构马赛克Cap蛋白基因进行替换,新设计的PCV2病毒基因组全基因合成后进行真核表达载体构建、PK-15细胞转染及筛选,获得一株新型PCV2毒株,命名为马赛克PCV2 SD株。马赛克PCV2 SD株制成疫苗免疫小鼠,小鼠血清中检测不到诱骗抗体,且与PCV2 HeB-1免疫组相比,血清中和抗体水平提高1.6倍以上。4.将含猪干扰素-γ基因(PoIFN-γ)的真核表达质粒转染PK-15细胞,获得一株可稳定表达PoIFN-γ的PK-15细胞系,命名为PK15-PoIFN-γ细胞系。PK15-PoIFN-γ细胞可显著增强马赛克PCV2 SD株的增殖效率,病毒毒价达1×10~(8.4) TCID_(50)/mL以上,且连续传15代后对病毒的增殖无影响。5.改构马赛克Cap蛋白经密码子优化后成功实现大肠杆菌高效表达。改构马赛克Cap蛋白与Gel 01ST佐剂乳化制备成疫苗并免疫仔猪,免疫后14d仔猪血清中即可检测到PCV2特异性抗体,攻毒后仔猪未检测到病毒血症,组织病理变化轻微,腹股沟淋巴结中PCV2病毒含量很低,PCV2特异性IFN-γ-SC的数量显著增加,与攻毒对照组相比差异显著(P0.05)。同时,改构马赛克Cap蛋白亚单位疫苗对PCV2d HeB-1株、PCV2b LN-3株均能达到保护效果。6.改构马赛克Cap蛋白与佐剂乳化后免疫小鼠制备单克隆抗体,获得15株单抗并完成其中4株单抗(2C5、4G7、5F7、6F8)的鉴定。4株单抗均与改构马赛克Cap蛋白发生特异性反应,与PCV2病毒产生特异性的免疫荧光信号,且与CSFV、PRRSV、PRV、PPV等猪常见病毒无特异性反应。单抗6F8、2C5为PCV2的中和性抗体,其中单抗6F8对PCV2病毒各基因型均有中和活性,而单抗2C5仅对PCV2d亚型毒株有中和活性。7.以PCV2中和单抗6F8为基础,制备了一种PCV2血清中和抗体阻断ELISA试剂盒。以血清中和抗体检测试验结果为标准,PCV2血清中和抗体阻断ELISA试剂盒的检测敏感性为98.9%,特异性为78.9%,与细胞中和试验的符合率为93.3%,批内批间变异系数小于10%,可4℃保存1年以上。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4
【图文】：

图 2-3 PCV2b 或 PCV2d 攻毒后仔猪血清中 PCV2 的含量Fig.2-3 PCV2 DNAin sera after challenge of pigs with PCV2b or PCV2图 2-4 仔猪淋巴结中 PCV2 抗原的免疫组化检测结果unohistochemical detection of PCV2 antigen in the lymph nodes of expCV2b 的抗原检测 B：攻毒 PCV2b 组的抗原检测 C：攻毒 PCV2dntigen was detected from the control group. (B) PCV2b antigen was deh PCV2b strain. (C) PCV2d antigen was detected in the inguinal lymphchallenged with PCV2d strain.

图 2-4 仔猪淋巴结中 PCV2 抗原的免疫组化检测结果Fig.2-4 Immunohistochemical detection of PCV2 antigen in the lymph nodes of experimental pigsA：对照组 PCV2b 的抗原检测 B：攻毒 PCV2b 组的抗原检测 C：攻毒 PCV2d 组的抗原检测A： PCV2b antigen was detected from the control group. (B) PCV2b antigen was detected from pigschallenged with PCV2b strain. (C) PCV2d antigen was detected in the inguinal lymph nodes from pigschallenged with PCV2d strain.2.3 讨论PCV2 是 PCVAD 的主要病原体，给全球养猪业造成了巨大的经济损失，对其进行系统的流行病学监测具有重要意义。目前，已报道的 PCV2 病毒分为 5 种基因型，分别以 PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e 等命名。2009 年至 2010 年间，PCV2的主要基因型从 PCV2a 向 PCV2b 转变，2010 年以后，PCV2d 基因型成为世界的主要流行基因型(Cai et al. 2012; Guo et al. 2010)。PCV2 基因型的转变可能受到疫苗免疫压力的影响。Reiner 等对免疫 PCV2 疫苗(基于 PCV2a )的猪场和未免疫 PCV2 疫苗的猪场中分离病毒的 PCV2a 和 PCV2b 基因型占比进行了研究，结果表明 PCV2a 占比从

图 3-1 重组质粒 PVAX1-ORF2 和 PVAX1-ORF2-C3d-P28.3 的构建Fig. 3-1 Construction of the plasmids PVAX1-ORF2 and PVAX1-ORF2-C3d-P28.3A：质粒设计图 B：质粒酶切图谱A：Construction of the two plasmids B：Restriction digest of the two plasmidspVAX1-ORF2 和 pVAX1-ORF2-C3d-P28.3 转染 PK-15 细胞后，均可见特异性免疫荧光，PCV2 ORF2 基因在 PK-15 细胞中实现了体外表达(图 3-2 )。A B CPVAX1-ORF2PVAX1-ORF2-C3d-P28.3 ORF2Nhe IC3d-P28 C3d-P28 C3d-P28Hind IIIGGGGSGGGGSLINKERORF22000bp750bp250bp5000bp1000bp250bp

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘颖f3;周智;关婕葳;原霖;侯伯;赵柏林;王传彬;杨林;;猪圆环病毒3型感染的流行情况与检测方法研究进展[J];畜牧与兽医;2019年01期

2 李天芝;;猪圆环病毒3型的流行与防控[J];养猪;2019年02期

3 张建亮;;猪圆环病毒的危害与净化[J];畜牧兽医科技信息;2019年04期

4 陈大虎;;猪圆环病毒感染疾病及防控措施[J];畜牧兽医科学(电子版);2019年05期

5 咸文;梁海英;;猪圆环病毒3型在韩国猪群中的流行状况调查[J];中国畜牧兽医文摘;2017年11期

6 陈娟;梁海英;曾智勇;P.J.Collins;;猪圆环病毒3型在英国的感染情况调查[J];猪业科学;2018年04期

7 徐镀涵;王燕;谢玲玲;李波;;贵州省7个市(州)猪圆环病毒2型的流行病学调查[J];贵州畜牧兽医;2018年03期

8 张爱琼;梁海英;曾智勇;Ye;;猪圆环病毒3型在瑞典猪群中的检测和遗传特征分析[J];猪业科学;2018年07期

9 张爱琼;梁海英;曾智勇;Saraiva G L;Vidigal PMP;Fietto J L R;;猪圆环病毒3型的古老起源和全球分布分析[J];猪业科学;2018年08期

10 何小莉;梁海英;曾智勇;汤德元;王彬;黄涛;徐国;叶百川;咸文;张爱琼;陈娟;吴好叶;;猪圆环病毒研究进展[J];猪业科学;2018年09期

相关会议论文 前10条

1 赖笑娴;洪伟彬;李永福;黄炳炽;;广东省部分地区猪圆环病毒2型流行病学调查[A];第25届广东省科技进步活动月畜牧兽医学术与科技创新发展大会论文集[C];2016年

2 蒋敏;薛明岩;王爱萍;;河南猪圆环病毒2型流行病学研究进展[A];第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2017年

3 张慧敏;盛宗海;韩鹤友;何启盖;李文涛;;纳米金增强免疫化学发光法检测猪圆环病毒2型[A];中国化学会第十五届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文集[C];2009年

4 张盼盼;贾松涛;刘星;;猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染的诊治[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（上册）[C];2009年

5 周双海;汤世坤;邵小雪;;猪圆环病毒2型体外感染后猪血管内皮细胞中共刺激分子和细胞因子的mRNA转录动态[A];第四届中国畜牧科技论坛论文集[C];2009年

6 程荣华;刘云志;孙健;呼延含蓉;赵欣;邵洪泽;张丽媛;杨金生;;浅谈猪圆环病毒研究现况[A];低碳经济与科学发展——吉林省第六届科学技术学术年会论文集[C];2010年

7 邓治邦;王乃东;罗维;许道军;;小鼠实验性感染猪圆环病毒2型的淋巴细胞凋亡观察[A];中国畜牧兽医学会——第三届中国兽医临床大会论文集[C];2012年

8 王一平;郭龙军;唐青海;刘长明;;猪圆环病毒2型疫苗的研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年

9 邵小雪;谢俊岭;高峰;周双海;;嵌合猪圆环病毒对仔猪的免疫保护研究[A];“生泰尔”杯全国养猪技术征文大赛——中国畜牧兽医学会养猪学分会五届三次理事会暨生猪产业科技创新发展论坛论文集[C];2012年

10 翟少伦;岳城;冉多良;龙进学;袁世山;;猪圆环病毒2型新疆株全基因组的滚环扩增与序列分析[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会论文集[C];2010年

相关重要报纸文章 前10条

1 栗卫东;如何防治猪圆环病毒与附红细胞体的混合感染[N];河北科技报;2017年

2 信阳农林学院 刘涛 王瑞;新生仔猪圆环病毒与葡萄球菌混合感染的诊治[N];河北科技报;2017年

3 信阳农林学院 刘涛 王瑞;一例猪圆环病毒、伪狂犬及副伤寒混感的综合防控[N];河北科技报;2016年

4 临城县畜牧办公室 张荣连;猪圆环病毒与肺炎混感的诊治[N];河北科技报;2014年

5 李凯年 译;日本韩国发现猪圆环病毒感染[N];中国畜牧水产报;2001年

6 江苏省农科院兽医所 俞正玉 林继煌;猪圆环病毒感染[N];江苏农业科技报;2004年

7 北京禾丰牧业科技有限公司 林世磊;猪圆环病毒感染的诊治[N];河北科技报;2015年

8 记者 乔地　通讯员 闻亚丽;“猪圆环病毒”疫苗批准上市[N];科技日报;2010年

9 记者 尹江勇;“猪圆环病毒疫苗”技术实现国产化[N];河南日报;2010年

10 记者 孟山　李松战;猪圆环病毒疫苗在洛研制成功[N];洛阳日报;2010年

相关博士学位论文 前10条

1 崔红杰;永生化猪口腔黏膜上皮细胞系的建立及猪圆环病毒2型和口蹄疫病毒增殖特性的研究[D];西北农林科技大学;2019年

2 侯竹美;猪圆环病毒2型新型疫苗的研制及中和抗体快速检测方法的建立[D];西北农林科技大学;2019年

3 侯强;核定位信号肽介导猪圆环病毒2型Cap蛋白出核机制的研究[D];中国农业科学院;2018年

4 潘杰;猪圆环病毒2型灭活疫苗（YZ株）的研制及免疫效力评价[D];扬州大学;2018年

5 刘俊斌;生物反应器悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型灭活疫苗及其质量评价研究[D];扬州大学;2018年

6 湛洋;PCV2 Cap蛋白羧基端氨基酸残基的功能性研究[D];湖南农业大学;2017年

7 李瑞香;规模化自繁自育猪场猪圆环病毒2型血清学调查及对母猪、生长育肥猪生产性能的影响[D];甘肃农业大学;2016年

8 温立斌;猪圆环病毒2型的分子流行病学研究[D];中国农业大学;2005年

9 司兴奎;猪圆环病毒2型感染对猪免疫功能影响的细胞与分子机制[D];中国农业大学;2005年

10 朱玲;猪圆环病毒Ⅰ型、Ⅱ型全基因克隆及其基因交换重组的研究[D];四川农业大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 武乐yN;猪圆环病毒2型Cap蛋白在CHO-K1细胞系中的真核表达及鉴定[D];郑州大学;2019年

2 武迪;猪圆环病毒2型高代次毒株致病性与Cap-SS亚单位疫苗免疫效果测定[D];南京农业大学;2017年

3 徐祥兰;宿主miRNA-98对猪圆环病毒2型复制与表达的调控作用[D];南京农业大学;2017年

4 吴萌萌;猪圆环病毒2型ORF5互作蛋白GPNMB的鉴定及其在病毒复制中的作用研究[D];西北农林科技大学;2018年

5 李然;猪圆环病毒2型ORF5蛋白诱导猪肺泡巨噬细胞自噬作用及对病毒复制的影响[D];西北农林科技大学;2018年

6 刘盼娆;猪圆环病毒2型Cap基因在大肠杆菌中的可溶性表达与免疫特性研究[D];南京农业大学;2016年

7 邢广源;我国14个省市猪圆环病毒3型PCR检测及部分阳性样品的全基因组序列测定与分析[D];河南农业大学;2018年

8 徐朋丽;PCV2河南株的分离及PD-1/PD-L1通路对PCV2感染影响的初步研究[D];河南农业大学;2018年

9 李明亮;河南部分地区PCV2流行病学调查及卵黄抗体制备[D];河南农业大学;2018年

10 马华魁;福建省部分规模猪场猪圆环病毒疫苗免疫效果评价与分析[D];福建农林大学;2018年

本文编号：2750651