基于唾液蛋白组学开发鉴定水牛发情方法的研究

发布时间：2020-07-11 16:05

【摘要】：发情鉴定的准确性是影响水牛的繁殖性能的重要因素。生产中大约有50%左右的水牛发情现象不能被准确监测,导致错过了最佳配种时间,造成经济损失。因此,筛选一种简单可行的鉴定水牛发情的方法,对水牛生产和繁育具有重要意义。本研究以非侵入性的体液(唾液)作为试验材料,对成年母水牛整个发情周期的血液和唾液激素变化,发情期唾液结晶变化与卵巢卵泡发育进行关联分析;以蛋白定量技术(iTRAQ,isobaric tags for relative and absolute quantitation)分析了不同发情期的差异蛋白并进行验证。主要研究结果如下:1.水牛唾液和血液发情周期生殖激素的变化规律。本研究采用酶联免疫分析方法(ELISA)分别对水牛整个发情周期的唾液和血液的生殖激素水平变化规律进行测定:水牛血液和唾液中的E2和P4呈波动性变化,发情前期,唾液中P4浓度一直维持在6.5～7.1ng/mL,第13天达到峰值,随后快速下降。唾液中E2浓度在发情前期第3～5天出现一个峰值,在14～17d唾液中E2浓度显著升高,出现第二个峰值。唾液E2和P4浓度的变化趋势和血清E2和P4浓度的变化趋势基本一致。母水牛唾液E2和P4浓度相关性极显著相关(R=0.7754,P0.01),母水牛唾液和血清标本的FSH浓度相关性显著(R=0.3471,P0.05)。2.发情周期唾液结晶几何结构分析。水牛发情周期唾液表现为蕨类植物形态,树枝样形态,松针样形态,圆点型,树枝型-蕨类植物结合型等多种形态;发情当天可见典型的蕨类植物形态和树枝样形态。经B超同步检测卵巢上卵泡的发育情况发现,典型的唾液结晶形态与发情当天卵巢上优势卵泡的发育相一致,且唾液结晶的分形几何分析得出,发情当天分形维值最低。3.水牛唾液生殖激素、唾液结晶和卵泡变化进行关联分析。水牛发情当天唾液雌激素的水平为240.16±32.92pg/mL,达到一个峰值,随后开始缓慢的降低。水牛唾液中孕激素水平在发情前48小时达到了 16.50±5.82ng/mL,发情当天降低到8.95±7.50ng/mL。水牛发情阶段LH在发情前24小时逐渐下降,激素水平从6.05 ±0.81 ng/mL到3.95士2.06ng/mL;但在发情后12小时后逐渐升高,达到6.22±1.68ng/mL。FSH激素水平基本比较平稳,变化不大。B超监测卵巢卵泡卵泡从发情前2天迅速生长,到发情当天达到20mm左右,卵泡的大小直到破裂排卵变化不显著。排卵后形成的黄体,黄体期一直维持到下次发情前四天左右,期间在发情后14～17天黄体的最大,与前面得出的水牛唾液中促黄体激素分泌峰一致。并对并对唾液结晶方法、直肠检查法、唾液结晶+B超、直肠检查+B超四种方法进行了生产中的验证,得出唾液结晶+B超的发情率最高,妊娠率比其他组高,但差异不显著。4.选取发情周期水牛的唾液作为试验材料,采用iTRAQ蛋白质组定量技术鉴定水牛发情周期的差异蛋白表达。共鉴定1160个蛋白质,VENN图对发情周期的不同阶段的组别(间情期:发情前期;间情期:发情期;间情期:发情后期;间情期:发情前期+发情期+发情后期)进行分析发现,这四个组有105个共有蛋白,发情期与间情期组有87特有差异蛋白。所有鉴定到的蛋白分别参与到了 7个代谢通路中,参与蛋白数量最多的通路是唾液分泌,应用生物学信息分析软件进行了差异蛋白的网络互作分析。发情期与间情期组的差异蛋白质之间的互作关系网络图分析发现共有297个点,形成的两两互作关系有1272个,显示最高的基因是“ENO1”。5.采用免疫印迹法对水牛发情周期筛选的差异蛋白SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70、ENDOU 进行了验证。验证的蛋白中 SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70 蛋白在发情期唾液中的表达量的比间情期、发情前期和发情后期这三个发情阶段的变化明显提高。ENDOU(PP11)蛋白的表达量在发情前期升高,发情期降低。验证蛋白的变化趋势和蛋白组学研究结果相一致。不同水牛的SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70三个蛋白验证结果与上述结果也一致,ANNEXIN、HSP-70可能作为后续试剂盒开发的候选蛋白用于后续的研究。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.83
【图文】：

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技术流程

与其他体内标记和非标记蛋白质组学研究技术相比，ｉＴＲＡＱ技术具有的优点如下：逡逑１）高灵敏度，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白，膜蛋白，核蛋白等；２）分离能力逡逑强，叶分离出小■！？邋１０Ｋ或者大于２００Ｋ难溶性的酸性或碱性蛋白；３）高通Ｍ，可同时逡逑对处理方式不同的８个样品进行差异蛋白分析（王文文，２０１６）邋；邋４）可Ｎ时得出准确逡逑可靠的鉴定和定量结果。重复样品间蛋白的表达量相关性可达到０．９５以ｈ。５）邋ＬＣ和逡逑ＭＳ／ＭＳ连用，适用于任何类型的样本，可实现自动化操作，分离纯化效果好，分析速逡逑度快（庞琪，２０１６）。但要求必须有可供参考的数据祚、转录ｍ或基闲组注释信息提供。逡逑

唾液,蕨类植物,松针,发情周期

本试验对观察到的发情牛只进行了整个发情周期唾液样品的采集，对８头母水牛的逡逑唾液样品连续采集２个发情周期以上进行研究，我们对水牛整个发情周期的３２７个样品逡逑的唾液结晶模型进行了分析，下面为其中１个发情周期２４天的唾液结晶图（如图３－２逡逑所示），从唾液结晶图形中可以观察到在发情当天（ＤａｙＯ）为典型的蕨类植物结晶图形逡逑和第１９天为典型的树枝状结晶图形。逡逑３６逡逑

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