肉碱对冻融后猪精子生物学特性及抗氧化、抗凋亡的影响

发布时间：2020-07-11 18:45

【摘要】：自冷冻配子技术发明以来,大多数哺乳动物的冷冻精液技术得到了突飞猛进的发展,商品化效果较好。猪由于其精子抗冷冻打击能力差,冷冻精液的商品化效果不甚理想,目前多采用鲜精人工授精的方法。肉碱(Carnitine)自发现以来,因其在抗氧化方面的效果甚佳,目前多用于改善精子质量的各种药剂中,并在临床中取得了一定的效果。本试验意在探究肉碱对猪精子冻融后质量、精卵结合能力的影响,及其对精子凋亡因子Bax、Bc1-2、Caspase-3的mRNA表达水平和抗氧化酶SOD 2、CAT、GPx1的mRNA表达水平的影响。采用向冷冻液中添加不同浓度的肉碱,对精子进行冻融处理并检测鲜精及冻融后精子的各项生物学特性与脂质过氧化产物丙二醛(MDA)浓度及总抗氧化能力,以证明冻融后猪精子的质量大幅下降,及肉碱确实能够影响猪精子的冻存质量,并筛选出肉碱保护作用最强的添加浓度。对比鲜精组、无肉碱添加组及最佳浓度组的凋亡相关基因、抗氧化相关基因mRNA表达水平。用荧光染色技术对比鲜精组、无肉碱添加组及最佳浓度组的精卵结合情况。试验得到以下结果:1.冷冻液中添加不同浓度的肉碱(0、0.025、0.05、0.075 mg/ml)冻融后,各组精子活动率、质膜完整率、顶体膜完整率均低于最佳肉碱浓度组(0.05 mg/ml),各处理组间活动率、质膜完整性差异性均显著,除0.025及0.075 mg/ml处理组外各组间顶体膜完整性均差异显著(P0.05)。各冻融组与鲜精相比,其MDA浓度均显著增加,其中最佳浓度处理组较其他各处理组MDA浓度最低,其余各处理组间差异不显著(P0.05)。各冻融组与鲜精相比,其总抗氧化能力均显著降低,其中最佳浓度处理组较其他各处理组总抗氧化能力最高且与各处理组差异显著,其余处理组间差异不显著(P0.05)。证明猪精子在冻融处理后确实质量下降,且肉碱对猪精子的冻存质量存在积极影响。2.与鲜精相比,冻融后精子中促凋亡相关基因mRNA表达水平显著增加,抗凋亡相关基因mRNA表达水平显著降低,抗氧化酶相关基因mRNA表达水平显著降低(P0.05)。与无肉碱添加组相比,最佳浓度组精子中促凋亡相关基因表达水平显著降低,抗凋亡相关基因mRNA显著增加,抗氧化酶相关基因含量显著增加(P0.05)。3.使用鲜精、无肉碱添加组、最佳浓度组精子进行人工授精并使用荧光染色,结果显示鲜精组精子黏附数最多,最佳浓度组精子黏附数较少,无肉碱添加组精子黏附最少。结果显示,肉碱的添加可以有效降低冻融过程中精子受到的不利影响,提高精子的冻存质量。肉碱可影响精子冻存中的凋亡相关基因表达和抗氧化酶相关基因表达。肉碱可以改善冻存精子的精卵结合能力。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828
【图文】：

肉碱,猪精子,含量影响,精子

３．２添加肉碱对精子冻融后脂质过氧化的影响逡逑破碎各组冻融后精子，提取离心后的上清液比较添加不同量肉碱的精液中的逡逑丙二醛浓度。所得数据经统计分析，结果如图３－１所示。对照组（鲜精）与各处逡逑理组相比，经过冻融处理的精液中丙二醛（ＭＤＡ）浓度均升高，其中０．０５邋ｍｇ／ｍｌ逡逑添加量的处理组ＭＤＡ浓度显著低于其他各处理组（Ａ０．邋０５），其次是０．邋０２５邋ｍｇ／ｍｌ逡逑添加量的处理组，0．邋０７５邋ｍｇ／ｍｌ添加量的处理组ＭＤＡ浓度最高，除０．邋０５邋ｍｇ／ｍｌ逡逑添加量的处理组。说明向冷冻保护剂中添加适量肉碱可以降低冻融精子中丙二醛逡逑含量。逡逑３本逦ａ逦ａ逡逑＿逦２．５逦ｐｉ邋＿邋ｂ邋＿逡逑Ｐ：ｉｊＬ邋Ｘ逡逑０ｉｉｉ邋１１逦１１逦１逦１１邋＿逡逑对照组邋０逦0？邋０２５邋０．０５邋０．０７５逡逑图３－１．不同浓度肉碱对冻融猪精子ＭＤＡ含量影响。逡逑ｆｉｇ邋３￣１．邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃａｒｎｉｔｉｎｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｎ邋ＭＤＡ邋Ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ逡逑ｆｒｏｚｅｎ－ｔｈａｗｅｄ邋ｂｏａｒ邋ｓｐｅｒｍ．逡逑注同一性状不同小写字母肩标的平均值间差异显著（Ｋ0．邋０５），横坐标单位逡逑为ｍｇ／ｍｌ。逡逑３．３添加肉碱对精子冻融后总抗氧化能力的影响逡逑破碎各组冻融后精子，提取离心后的上清液比较添加不同量肉碱的精液的总逡逑抗氧化能力。所得数据经统计分析，结果如图３－２所示。对照组（鲜精）与各处逡逑理组相比，经过冻融处理的精液总抗氧化能力均降低，其中０．０５邋ｍｇ／ｍｌ添加量逡逑的处理组总抗氧化能力显著高于其他各处理组

肉碱,猪精子,总抗氧化能力,凋亡相关基因

的比值作为相对表达量进行分析，以对照组的相对表达量为１进行其余两组数据逡逑的分析整理（表３－２），结果显示：与对照组相比，冻融后精子中凋亡相关基因的逡逑ｍＲＮＡ相对表达量升高，抗凋亡基因Ｂｅｌ－２的相对表达量降低（图３－３）。逡逑与对照组相比，添加量为０的肉碱处理组中凋亡相关基因Ｃａｓｐａｓｅ邋３与Ｂａｘ逡逑的相对表达量显著升高（（１±０．邋０５°ｖｓ２．邋０８邋±邋０．邋１４ａ，邋１邋±邋０．邋０６°ｖｓｌ．邋７４邋士逡逑０．０８ａ，／＜０．０５），抗调亡基因Ｂｃｌ－２的相对表达量显著降低（ｌ±0．邋０４ａｖｓ０．邋４９土逡逑０．邋０３ｅ，代０？邋０５），且Ｂｃｌ／Ｂａｘ比值为０．邋２９。与添加量为０的肉碱处理组相比，在逡逑冷冻液中添加０．邋０５邋ｍｇ／ｍｌ肉碱可以降低凋亡相关基因Ｃａｓｐａｓｅ－３与Ｂａｘ的相对逡逑表达量（２．邋０８±０．１４ａｖｓｌ．６０±０．０７ｂ，１．７４±０．邋０８ａｖｓｌ．５０±０．０６ｂ，邋Ｋ０．邋０５），显逡逑著增加抗凋亡基因Ｂｅｌ－２的相对表达量（0？邋４９±０．邋０３°ｖｓ邋０．邋７８±０．邋０１ｂ，邋Ｋ０．邋０５），逡逑且Ｂｃｌ／Ｂａｘ比值为０？邋５２。因此推测肉碱可通过影响凋亡相关基因ｍＲＮＡ的表达抑逡逑制冻融后精子的凋亡。逡逑２６逡逑

柱状图,肉碱,凋亡相关基因,柱状图

比值作为相对表达量进行分析，以对照组的相对表达量为１进行其余两组数据的逡逑分析整理（表３－３），结果显示：与对照组相比，冻融后精子中抗氧化相关基因逡逑Ｓ０Ｄ邋２、ＣＡＴ与ＧＰｘ的相对表达量降低（图３－４）。逡逑与对照组相比，添加量为０的肉碱处理组中抗氧化相关基因的相对表达量显逡逑著降低（１邋±邋０．邋０６ａｖｓ０．邋６１邋±邋０．邋０４ｃ，１邋±邋０．邋０５ａｖｓ０．邋６０邋土邋０．邋０３°，１邋±邋０．邋０７ａｖｓ０．邋３４邋士逡逑０．０２ｅ，Ｋ０．邋０５），与添加量为０的肉碱处理组相比，在冷冻液中添加０．０５邋ｍｇ／ｍｌ逡逑肉碱可以增加抗氧化酶相关基因ｍＲＮＡ的相对表达量（０．邋６１±０．邋０４ａｖｓ０．邋７９土０．邋０５ｂ，逡逑０．邋６０±０．邋０３ｅｖｓ０．邋７９±０．邋０５ｂ，逦０．邋３４±０．邋０２ｅｖｓ０．邋５６±０．邋０３ｂ，Ｋ０．邋０５）。逡逑２７逡逑

【参考文献】