应用DIA技术研究长角血蜱唾液腺退化过程中蛋白的表达及磷酸化修饰变化

发布时间：2020-07-12 00:27

【摘要】：蜱隶属于节肢动物门(Arthropoda)蛛形纲(Arachnida)蜱螨亚纲(Acari)寄螨总目(Parasitiformes)蜱目(Ixodina)蜱总科(Ixodoidea)。分为硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)和纳蜱科(Nuttalliellidae)三个科。蜱寄生于脊椎动物体表并传播多种病原体,是危害性极强的一类媒介生物。蜱类吸血时造成宿主皮肤局部出血、水肿以及感染,加之蜱类携带大量病原微生物,使得蜱类成为仅次于蚊类的第二大危害性极强的吸血节肢动物。多种蜱传播的病原体会造成人畜共患,在极大影响畜牧业发展的同时,也威胁着人类的健康。本研究涉及的长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)隶属于硬蜱科(Ixodidae)血蜱属(Haemaphysalis),广泛分布于我国,可传播多种危险病原体,严重危害人类健康,因此对其开展相关研究具有重要的意义。唾液腺作为蜱不可或缺的辅助吸血器官,在蜱整个生命活动中发挥着重要的作用。伴随着雌蜱开始吸血,其唾液腺迅速发育,功能逐步完善。但当雌蜱饱血并从宿主体表脱落后,唾液腺丧失其功能,迅速退化。在此期间唾液腺腺泡发生自体溶解,大量吞噬泡出现。当雌蜱饱血4天时,其唾液腺退化殆尽直至消失。研究唾液腺退化对于探究蜱唾液腺发育调控的生理机制具有重要的意义,寻找促进唾液腺快速退化的蛋白,对于控制蜱类发育和繁殖具有很大帮助,因此在另一层面上对于控制蜱传病原体的传播起到关键作用。本实验室前期利用iTRAQ定量蛋白质组学方法研究长角血蜱饱血后唾液腺组织中全部蛋白质的动态变化。但由于iTRAQ技术对样品量需求较大等缺点,使得对于小个体样本难以实现磷酸化富集以及磷酸化修饰蛋白质组学研究。本研究采用可以微量样本操作,加之较高重现性以及稳定性的DIA定量蛋白质组学技术对长角血蜱唾液腺退化过程中蛋白的动态调控以及磷酸化修饰变化进行深入研究。研究结果共鉴定到2226条蛋白,其中差异表达蛋白524条。共鉴定到磷酸化蛋白635条,涉及到的磷酸化位点共1957个。磷酸化修饰出现变化的蛋白共576条蛋白,涉及到的肽段共1431条。运用生物信息学分析方法对差异表达蛋白以及差异磷酸化修饰位点进行系统分析。通过大量的RNA干扰工作,我们发现在唾液腺发育过程维持细胞能量平衡的蛋白AMPK被干扰后雌蜱吸血过程中的唾液腺腺泡与正常雌蜱相比出现了明显的萎缩,饱血体重、产卵量等均明显下降。调节细胞周期的蛋白CDC37在唾液腺退化过程中的磷酸化修饰出现了明显下调,我们对饥饿雌蜱中的CDC37进行了RNA干扰,发现雌蜱吸血过程中的唾液腺也出现了发育受阻的现象。Hippo能够促进细胞凋亡,该蛋白在雌蜱唾液腺退化过程中的磷酸化修饰程度出现了明显上调。该基因在饱血雌蜱中被干扰后,雌蜱唾液腺退化速度明显放缓,说明该蛋白具有明显促进唾液腺退化的功能。本研究致力于探索长角血蜱唾液腺退化过程的分子调节机制。研究结果比较清楚的展示了该过程中蛋白表达的整体动态变化和磷酸化修饰调节的动态变化,并找到了一些对于调控唾液腺退化具有重要意义的关键蛋白,为进一步有效控制蜱类发育和繁殖奠定基础,为蜱类综合防治提供了理论依据。
【学位授予单位】：河北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.746
【图文】：

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3.2 实验数据分析与筛选长角血蜱饱血 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h 各个时期唾液腺组织鉴定到主成分分析图，如图 2-1 所示，结果显示四次生物学重现性较高，数据时期鉴定到的蛋白的定量值计算 CV 值，取 CV 值小于 20%的数据，各 60%以上。采用韦恩图取交集的方法，将五个时期的定量数据以 CV 值筛选，再进行韦恩交集筛选。如图 2-2，五个时期都检测到的蛋白共释信息的的 15 条蛋白，后续均在 914 条蛋白质上进行分析。

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血蜱饱血后 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h 唾液腺组织中的韦恩交集图nn analysis of H. longicornis engorged salivary gland 0 h、1248 h identified the proteins表达蛋白热图分析时期四次生物学重复的定量信息取算术平均值，对饱血10 h、饱血 36 h : 饱血 0 h、饱血 48 h : 饱血 0 h 时期的差 2-3 所示，很直观的表现出了蛋白表达的情况。下调的织的退化，大多数蛋白的表达量逐渐降低，功能减退，调，可能在唾液腺退化这个过程中起到促进作用。

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3 长角血蜱唾液腺组织全部蛋白质差异表达热图分析eat map analysis of differential expressed proteins of H. loengorged salivary gland tissue all proteins表表达上调；蓝色代表表达下调；白色代表表达无差异蛋白聚类分析次生物学重复的定量信息取算术平均值，利用饱血 1 h、饱血 36 h : 饱血 0 h、饱血 48 h : 饱血 0 h 时期的所示，软件参数取 log2 即设置为上调大于 0.58 和下调 4。无差异表达的蛋白有 390 条，有差异表达的蛋白白，从饱血 0 h 到 48 h 呈下降趋势；Cluster 2 有 91 条r 3 有 183 条蛋白，从饱血 0 h 到 48 h 呈上升趋势；Clu6 h 呈下降趋势，36 h 到 48 h 呈上升趋势。数据结果显

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