禽滑液囊支原体灭活疫苗的初步研究

发布时间：2020-07-12 00:22

【摘要】：禽滑液囊支原体病是由禽滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)引起禽类的一种急性或慢性亚临床型呼吸道感染的疾病,感染可引发家禽气囊炎、腱鞘炎,关节及足垫肿胀并伴有炎脓性积液,给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。目前我国还无商品化的MS疫苗上市,本试验旨在开发出一种临床保护力较高的灭活疫苗来控制MS的感染,具体试验结果如下:为筛选出一株强毒株用于制备灭活疫苗,本研究对山东省滨州市某养鸡场疑似MS感染的气管棉拭子病料分离纯化三代后进行了PCR鉴定,将测序后的16S rRNA序列上传GenBank通过BLAST比对分析。结果显示:疑似MS的分离株在低倍显微镜下观察,菌落呈典型的“荷包蛋”状;PCR鉴定可扩增到特异性条带;测序结果经BLAST比对显示其与MS标准菌株(WVU1853)和河南商丘分离株(CHN-SQ27-2017)的相似性均为99%,证明获取的CHN-J2-2016分离株为MS。用CHN-J2-2016分离株感染21日龄的鸡,攻毒后11天和21天进行剖检,结果证实CHN-J2-2016分离株致病性强,能引起典型的足垫肿胀及关节滑液囊炎,因此可将禽滑液囊支原体CHN-J2-2016强毒株作为灭活疫苗的候选菌株。为了了解禽滑液囊支原体CHN-J2-2016株的生长特性,确定CHN-J2-2016株在疫苗生产工艺中抗原的最佳收获时间,制备四种不同佐剂的灭活疫苗。本试验利用支原体活菌数检测常用的颜色变化单位(color change units,CCU)、菌落形成单位(Colony forming units,CFU),以及蛋白浓度和核酸含量检测法检测108 h内CHN-J2-2016株的生长变化并绘制生长曲线。CCU、CFU结果显示,CHN-J2-2016株在改良Frey液体培养基内12~48 h进入对数期,CCU法显示48 h活菌数最高可达10~8 CCU/mL,CFU法显示48~54 h间的活菌数最高可达1.53×10~8CFU/ml;蛋白浓度结果显示自6 h开始增长,至48 h达到最高为390.8 ug/mL;核酸含量结果显示自12 h开始增长,循环值至48 h达到最高为20.56。因此,可将48~54h作为CHN-J2-2016株疫苗生产工艺中抗原的最佳收获时间。大体积培养收获抗原制备的四种灭活疫苗物理性状均良好,且能在4℃保存半年。为探讨制备的四种灭活疫苗的免疫原性,本试验随机选取190只30日龄的鸡按10只/组分为19组,所有鸡30日龄首次免疫,60日龄再次加强免疫。前9组按组分别皮下免疫四种疫苗与四种佐剂各0.25 mL/只,同时设阴性对照组;并于首免后7d至180d内每隔7d每组随机抽取5只鸡翅下静脉采血测血清抗体。后10组按组分别皮下免疫四种疫苗与四种佐剂各0.25mL/只,同时设阴、阳性对照组。所有试验组及阳性组在首次免疫后42d后进行攻毒试验,攻毒后10d和20d每组取5只病鸡进行临床评价打分及病理剖检。血清抗体检测结果显示:不同组在免疫后的抗体水平均呈现不同程度的增长,但只有71R VG+Ag组于首次免疫后血清抗体水平明显增高,随后抗体滴度微微下降但仍保持稳定。攻毒试验结果显示攻毒后各免疫组及阳性对照组在攻毒后均出现不同程度的发病症状,喉头取样的棉拭子均能分离出MS;喉头组织提取DNA后根据循环值显示免疫组喉头MS定植量要低于对照组;气管切片镜检显示攻毒后所有组的气管粘膜不同程度的增厚,但疫苗组的病变要低于佐剂组;病理剖检结果显示攻毒后气囊发病不明显,但足垫及关节均出现不同程度的肿胀及化脓性积液。上述试验结果证明,四种疫苗都能不同程度的刺激机体产生抗体反应,但只有71R VG+Ag组免疫后既能产生高水平的抗体又具有很好的临床保护效力。本研究成功分离鉴定了一支禽滑液囊支原体强毒株作为灭活疫苗的候选菌株,通过对其生长特性的研究,确定疫苗生产工艺中抗原的最佳获取时间为48h并制备了四种灭活疫苗。动物试验结果显示,四种疫苗都能不同程度的刺激机体产生抗体反应,其中71R VG+Ag组的临床保护效力最高。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

分子鉴定,精氨酸,尿素,葡萄糖

图 1 低倍镜下观察禽滑液囊支原体单菌落（10X）Fig 1 Single colony of MS observed under the low power CHN-J2-2016 株的生化鉴定检测结果株能发酵葡萄糖，不水解精氨酸，不利用尿素 CHN-J2-2016 株的分子学鉴定检测结果SrRNA 基因电泳结果2-2016 株的 16SrRNA 分子鉴定结果显示扩增片的片段大小相符（图 2）。

电泳图,电泳,滑液囊,病鸡

图 2 PCR 扩增产物的电泳结果Fig 2Agarose gel electrophoresis result of PCR pro000Marker；1：阳性对照；2：阴性对照；3：CHN-J2-2DNAMarker; 1: positive control; 2: Negative control; 3: PCCHN-J2-2016 strain 扩增产物 16sRNA 基因克隆及序列分析结果扩增产物的 16SrRNA 基因序列经过测序后，扩增考株WVU1853及本实验室分离到的禽滑液囊支的同源性，证实该分离株 MS。囊支原体 CHN-J2-2016 株致病性的检测结果第 11d 和第 21d 分别进行剖检，结果表明对照组好。而攻毒组的病鸡逐渐表现出沉郁喜卧、关节

关节,养禽业,亚临床,外分泌

Fig 3 Foot-pad lesions of chickens infected with CHN-WF224-2016 isoA：正常鸡足垫；B：感染 CHN-J2-2016 株的肿胀足垫；C：足垫有炎性D：关节有炎性渗出A: Normal foot pad; B: Swollen food pad infected with CHN-WF224-2016 C: Foot-pad lesion with cloudy fluid; D:Arthritis with cloudy fluid3 讨论MS 是一种能够引起禽群慢性亚临床性感染的疾病。可经蛋垂直经呼吸道及外分泌液呈水平传播[53]，具有发病率高、死亡率低的传播原感染后可终身定植于鸡体内，虽不引起鸡群的死亡，但能够逃避宿疫系统造成免疫抑制从而诱发多种病原的继发感染。MS 自 1954 年以来，逐渐呈世界性分布[54]。在欧美等一些发达国家，根据其流行病表明其阳性检出率甚至要高于 MG。在我国，自 2008 年以来，MS 感趋势逐年增加，尤其是近两年，在我国一些养禽业大省 MS 的感染呈爆

【参考文献】