猪链球菌2型激活炎性小体致中毒样休克综合征分子机制的研究

发布时间：2020-07-12 05:35

【摘要】：1998年和2005年在中国爆发人感染猪链球菌的疾病引起了全世界对于猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)的关注。阐明该菌的致病机制以及病原与宿主之间的相互作用,对于预防和治疗该疾病有重要的意义。本论文基于小鼠模型,揭示猪链球菌2型所致链球菌中毒样休克综合征(streptococcal toxic-shock-like syndrome,STSLS)与炎性小体、炎性因子“风暴”之间的关系。1.炎性小体激活在猪链球菌诱导的STSLS中发挥作用2005年四川疫情爆发时分离的菌株猪链球菌2型SC-19感染小鼠,造成小鼠STSLS的发生,以高炎性因子“风暴”、多组织损伤、高致死率为特征。而在感染中以caspase-1的抑制剂抑制炎性小体激活时,可以明显缓解猪链球菌2型感染所致链球菌样中毒样休克综合征的相关症状,提高小鼠的存活率。为了进一步探究炎性小体在猪链球菌感染中扮演的角色,实验中对炎性小体下游的信号通路进行了阻断,结果显示阻断IL-1β不能提高小鼠的存活率,而使用IL-18的抑制性抗体,可以缓解SC-19感染所引起的STSLS。证实,炎性小体的激活在猪链球菌感染所致的STSLS中发挥作用。2.NLRP3炎性小体激活促进了猪链球菌诱导STSLS的发生为了证实猪链球菌能激活炎性小体,并探究其激活炎性小体的类型,我们在293T细胞中重构了NLRP1b、NLRP3、NLRC4、AIM2四种主要类型的炎性小体,以MOI=10的SC-19感染细胞,结果发现,SC-19主要激活NLRP3炎性小体。在人的THP1细胞和小鼠的J774a.1细胞中,利用CRISPR技术突变了nlrp3基因使NLRP3蛋白表达缺失。SC-19感染细胞后显示SC-19只能激活野生型细胞而不能激活缺失NLRP3的细胞的炎性小体,证实SC-19激活了NLRP3炎性小体且这个过程依赖钾离子外流。为了进一步阐明炎性小体激活在猪链球菌所致的STSLS中的作用,在小鼠感染模型上使用了NLRP3炎性小体特异性的抑制剂MCC950,观察MCC950是否能缓解SC-19引起的STSLS。结果发现,使用MCC950能缓解STSLS的相关症状,包括炎症因子的降低、多组织损伤程度降低、致死率的降低。以上结果说明,猪链球菌感染诱导NLRP3炎性小体的激活促进了STSLS的发生。3.猪链球菌通过溶血素的溶血活性激活NLRP3炎性小体为了探究SC-19的何种组分激活了炎性小体,收集实验室保存的不同猪链球菌突变体并构建溶血素溶血活性突变体msly(P353L)。首先分别用活的和热灭活的SC-19感染PMA分化THP1而来的巨噬细胞,发现仅有活的细菌能刺激细胞炎性小体的激活。再用不同的突变体感染细胞后,发现只有溶血素相关突变株:溶血素缺失突变体、溶血素溶血活性突变体不能激活炎性小体。为了进一步探究溶血素和炎性小体之间的关系,实验使用了纯化的重组溶血素蛋白直接刺激细胞,发现溶血素能剂量依赖性激活炎性小体。最后,在SC-19感染模型中,加入不同浓度溶血素溶血活性抑制剂-胆固醇,结果显示胆固醇能够剂量依赖地抑制链球菌感染引起的炎性小体的激活。结果证实,猪链球菌SC-19激活炎性小体的主要成分是溶血素且依赖其溶血活性。4.猪链球菌激活炎性小体是STSLS发生的重要原因为了进一步探究SC-19激活炎性小体在STSLS中的作用,利用野生株SC-19与溶血活性突变株msly(P353L)分别感染小鼠,结果显示在突变株感染组中,STSLS相关症状明显减轻,证实msly(P353L)诱发STSLS的风险降低,体内炎性小体激活是STSLS形成的重要因素。因该突变株msly(P353L)的毒力降低,我们尝试用该菌株作为弱毒疫苗,发现一次免疫即可提供完全保护,暗示该突变株有开发成为弱毒疫苗的可能性。5.流行毒株SC-19所致的STSLS与溶血素高表达相关比较流行株SC-19和欧洲强毒株P1/7溶血素的表达量,发现两者溶血素表达具有显著差异,且不同菌株炎性小体激活程度与溶血素表达量密切相关。为了探究溶血素的表达差异对猪链球菌诱发STSLS造成的影响,实验中构建溶血素表达质粒,并对溶血素缺失菌株进行回补,在相对低表达的菌株P1/7实现过表达。结果显示,回补菌株能表达溶血素且恢复毒力,而溶血素过表达的菌株能提高P1/7的致死率。这些结果显示溶血素的高表达在SC-19所致的STSLS中发挥重要作用。综上,我们证实了猪链球菌2型分泌的溶血素能激活NLRP3炎性小体,诱导炎性“风暴”,促进了STSLS的发生。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.611
【图文】：

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