牛肌内脂肪沉积相关候选基因S100A10和bta-miR-210的生物学功能研究

发布时间：2020-07-12 08:07

【摘要】：肌内脂肪含量是影响牛肉品质的重要因素。在肉牛育肥中,生产者希望获得肌内脂肪沉积丰富,饲料消耗少的牛只以获得更高的利润。因此,培育生长速度快,IMF含量高的肉牛品种具重要意义。肌内脂肪是沉积在骨骼肌肌纤维和肌束间的脂肪组织。脂肪组织含量是由细胞数量和细胞体积决定的,其沉积与分布受到基因与营养因素的调控。为了探究肉牛肌内脂肪发育的机理,本研究选取与牛肉质性状相关的基因S100A10和bta-miR-210作为研究对象,通过研究bta-miR-210和S100A10在体外成脂分化模型中的作用来初步解释其对生长性状的作用机制。以小鼠前体脂肪细胞为模型,通过转染siRNA干扰细胞内S100A10的表达来观察对小鼠前体脂肪细胞向白色/棕色成脂分化的影响,以此为S100A10基因对于肉牛肌内脂肪沉积的研究提供科学依据;bta-miR-210主要通过外源过表达和敲低靶基因来探究bta-miR-210对牛PDGFRα~+祖细胞成脂分化的影响。得到的主要结果如下:1、利用胶原酶消化法从12周龄小鼠腹股沟两侧的白色脂肪组织中分离前体脂肪细胞;利用胶原酶消化和细胞表面标记分选结合从5月龄胎儿牛背最长肌组织中获得PDGFRα~+祖细胞;2、小鼠前体脂肪细胞长满后进行白色/棕色成脂分化,同时用siRNA干扰S100A10基因的表达,诱导分化6天时脂滴明显变少;通过荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光观察影响成脂分化的特异转录因子显著下降;3、在胎儿牛PDGFRα~+祖细胞分化过程中通过定量检测bta-miR-210的表达量上调;4、过表达bta-miR-210,9天时观察脂滴明显变多;通过荧光定量PCR、蛋白免疫印迹检测成脂分化的标志性基因显著上升;5、通过双荧光素酶报告验证WISP2为bta-miR-210的靶基因。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823
【图文】：

组合方式

国内外不少研究者对牛的重要经济性状进行 GWAS，筛选到一部分与牛性状相关的基(Zhang et al., 2016; Chen et al., 2015; Finlay et al., 2012)。Jahuey 等团队通过对夏洛莱牛进行 GWA分析，筛选出与生长性状相关的基因TRAF6、CDH11和KLF7等(Zhang et al., 2016; Chen et al., 20Finlay et al., 2012)。Cesar 等人通过 SNP 芯片对 386 头内洛尔阉割牛进行基因分型，使用贝叶方法确定了可能与肌内脂肪沉积和组成相关的基因组区域和候选基因(Cesar et al., 2014)。肉牛肥中，生产者希望获得肌内脂肪沉积丰富，饲料消耗少的牛只以获得更高的利润。中国农业科院北京畜牧兽医研究所牛遗传育种创新团队本团队以 1 141 头西门塔尔牛为材料，使用 Illumi770 K 高密度芯片分型数据对肉质性状进行了 GWAS 研究，筛选到与大理石花纹评分性状显著关的候选基因 S100A10(Xia et al., 2016)。1.3 S100A10 研究现状S100A10 是 S100 家族成员之一，调控靶蛋白对胞内 Ca2+作出应答反应。与 S100 家族的其成员相比，S100A10 对 Ca2+是不敏感的，因为与 Ca2+相连接的地方被氨基酸替代。在细胞内S100A10 主要与外周膜结合蛋白 Annexin A2 结合成紧密的异四聚体复合物，具体的结合方式S100A10 二聚体与两个 Annexin A2 相结合，有 2 种结合方式，见图 1.1。

膜蛋白

图 1.2AnnexinA2-S100A10 参与的膜蛋白转运(Rescherand Gerke, 2007)Fig 1.2 Membrane protein trafficking pathways with involvement ofAnnexin A2 S100A10.Reddy 等(Reddy et al., 2012)在小鼠和人乳腺癌细胞中发现当沉默掉 S100A10 时，抑制了Annexin A2 与细胞膜的结合。目前，关于 S100A10 在脂肪代谢方面的研究鲜有报道。2017 年 Liu等(Liu et al., 2017)发现在人肝癌细胞中过表达 S100A10，其与细胞质中脂滴的位置一致；2016 年Ahmad 和 Alexes(Salameh et al., 2016)在小鼠模型中发现，Annexin A2 与抗增殖蛋白(PHB)、脂肪酸转运者(CD36)形成复合物参与脂肪组织中脂肪酸的跨膜转运。本研究以 S100A10 基因可能调控肉牛肌内脂肪沉积为出发点，采用小鼠白色前体脂肪细胞体外诱导分化模型，通过敲低 S100A10基因并诱导其白色/棕色成脂分化来探究 S100A10 基因对于前体脂肪细胞成脂分化的影响，进而研究脂肪沉积和能量消耗两个生物学过程中 S100A10 的功能。为进一步研究 S100A10 基因对于肉牛肌内脂肪沉积的影响提供理论支持。1.4 miRNA 的研究进展microRNA(简称 miRNA)是一类内生的、长度约 21-25 个核苷酸的小 RNA，最早被发现于线虫体内(Lee et al., 1993)，随后又被发现存在于植物、动物和一些病毒中，其在细胞内具有多种重要的调节作用。最近的研究表明大约 70%的哺乳动物 miRNA 基因是位于 TUs 区(Transcription

转录因子,棕色化,脂肪细胞

农业科学院硕士学位论文第一章够调节机体代谢，减少肥胖症和糖尿病等一些代谢疾病的发生。研究发现，视黄酸、冷刺些激素等都可以引起 WAT 棕色化(Barbatelli et al., 2010b; Wang et al., 2017; Asano et al.,emic et al., 2017; Ohno et al., 2012)。WAT 棕色化可以增加胰岛素敏感性，有研究证实可以食方面带来的肥胖(Kim et al., 2016)；还可以改善葡萄糖的耐受量，在肥胖的小鼠体内移植色脂肪细胞，可以明显看到空腹小鼠的血糖下降，耐受量得到改善(Min et al., 2016)。本研00A10 基因可能调控肉牛肌内脂肪沉积为出发点，采用小鼠白色前体脂肪细胞体外诱导分，通过敲低 S100A10 基因并诱导其白色/棕色成脂分化来探究 S100A10 基因对于前体脂肪脂分化的影响，进而研究脂肪沉积和能量消耗两个生物学过程中 S100A10 的功能。.1 脂肪细胞的分化形成过程目前普遍认为脂肪细胞是由于中胚层的 MSCs 逐渐分化而来，经过分化至脂肪祖细胞、肪细胞，最终分化为成熟的脂肪细胞。细胞分化的过程受到一些转录因子和激素的作用，着一系列成脂基因的相互作用和时序性表达，见图 1.3。细胞成脂分化过程大致可以分为段：定向前期、定向之后的生长期、生长抑制期、克隆扩增期、终末分化期和脂滴积累期阶段特点见表 1(Lefterova et al., 2009)。

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