欧亚类禽H1N1猪流感病毒分离鉴定及复制机制初步研究

发布时间：2020-07-12 11:24

【摘要】：猪流感是猪较为常见的呼吸道疾病,会引发咳嗽、打喷嚏、流鼻涕、发热和呼吸困难等症状。猪流感不但给养猪业带来巨大的损失,同时也严重威胁人类的健康,因此具有重要的公共卫生学意义。本研究从某发病猪场分离到一株H1N1亚型猪流感病毒,进一步分析显示,此病毒属于欧亚类禽猪流感病毒。利用RT-PCR技术,分别扩增到8个基因片段,克隆到流感病毒反向遗传系统载体上,将8个质粒共转染293T细胞,成功拯救了一株猪流感病毒。经测序显示,拯救得到猪流感病毒与亲本毒序列完全一致。比对序列发现,PB2基因存在两个启动子,多编码一个长度为71个氨基酸的蛋白,命名为PB2-X。通过定点突变的方法突变掉PB2基因多余的启动子(ATG-ATT),拯救出一株不表达PB2-X的突变毒株。通过分别在MDCK细胞与ST细胞上比较两株病毒的生长特性,结果显示两株病毒在ST细胞中复制能力均较强。通过生长曲线测定、聚合酶活性试验等试验证明了不表达PB2-X蛋白的突变毒株的复制能力优于原毒株。说明PB2-X蛋白的存在影响了病毒的体外复制能力。通过小鼠攻毒试验比较两株病毒的致病力,结果显示两组接毒小鼠的体重没有明显的降低,说明分离的欧亚类禽H1N1猪流感病毒对小鼠的致病性较弱,PB2-X对其致病性影响较小。本研究建立的欧亚类禽猪流感病毒反向遗传系统为研究其复制与致病机制奠定基础,并首次发现此欧亚类禽H1N1猪流感病毒PB2基因表达一个新的PB2-X蛋白。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【图文】：

病毒结构

低于 5%[4]。一旦继发感染了其他病毒养殖业来说，这是巨大灾难[5-6]。因为猪兼有人在同时感染猪的时候会在猪体内发生基因重组8]。因此，SI 具有很重要的公共卫生学意义和传遍及全球，呈全球流行的趋势，也成为了对猪生安全带来巨大威胁，所以应该加强对于猪流究。但由于猪流感病毒是RNA病毒，不容易对其学对基因组的操作提供了很大的便利[11]。子生物学形态结构下观察病毒，其形状可以为圆形或丝状，其直的纤突为 HA、NA、M2 组成的膜蛋白，其中凝活性并凝集鸡红细胞。内部结构为核衣壳[12]

病毒,载体,测序,质粒

形状较小，对照组并没有出现空斑，根据以上病毒。基因扩增与质粒构建结果毒通用引物对病毒 cDNA 进行 PCR 时，能够直接将所有 PCR 结果如下图所示。将反向遗传质粒 pLLB 载体进行图如下：1、2、3 道为酶切后的载体，第四道为原质粒，所以条带在线性化质粒的下方，这样就确定 1、2、3与片段连接。将扩增的 8 个基因片段分别与 pLLB 载体R 鉴定，鉴定结果为阳性的菌液送至测序公司测序，得到测进行 BLAST，结果显示 8 个片段均来源于欧亚类禽猪流，保存阳性菌液，质粒提取后测定的浓度和 OD 值均正病毒拯救试验。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

猪流感,测序,质粒提取,欧亚

鉴定结果为阳性的菌液送至测序公司测序，得到测，进行 BLAST，结果显示 8 个片段均来源于欧亚类禽猪流感功，保存阳性菌液，质粒提取后测定的浓度和 OD 值均正确行病毒拯救试验。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 132、3 为 NP，4、5、6 为 PA、7 为 Marker，8、9、10 为 PB1，11、12、13 为 P图 2 各基因的 PCR 结果Fig.2 The PCR result of gene1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

【参考文献】