过表达TLR4转基因绵羊单核巨噬细胞吞噬沙门氏菌的分子机制研究

发布时间：2020-07-12 18:43

【摘要】：单核巨噬细胞是动物机体中一类重要的免疫细胞,其发挥的吞噬细菌作用在病原菌入侵时发挥至关重要的作用。当动物的免疫细胞吞噬病原菌后可以激活多种免疫应答,随后对侵入的病菌进行清除。Toll样受体(Toll-like receptor)作为一类重要的模式识别受体,在不同种分子刺激下能够引发机体对病原体的免疫反应。其中TLR4在单核巨噬细胞等多种免疫细胞中表达。通过识别包括沙门氏菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌的细胞壁成分,激活下游多种信号通路并引发吞噬细菌、炎症反应、氧化杀伤等多种免疫反应,对最终在动物机体清除病菌中发挥着重要的作用。动物单核巨噬细胞识别并吞噬病原菌是细胞发挥其天然免疫反应的首要过程,而TLR4恰好是识别这些革兰氏阴性菌的最重要受体。Southern blot检测目前被认为是权威的鉴定转基因动物的方法。实验中首先采用地高辛标记探针、化学发光检测的Southern杂交技术,通过提取优质的基因组DNA,严格控制酶切条件、纯化探针、优化转膜及化学发光步骤等过程获得信号强、背景低、重复性好的Southern杂交结果。此外转基因阳性绵羊TLR4基因在mRNA水平及蛋白水平均得到了稳定高表达。过表达TLR4转基因绵羊单核巨噬细胞在TLR4配体LPS刺激下,其下游丝裂原活化蛋白激酶信号通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及胞内磷脂酰肌醇激酶信号通路(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)在半小时内被迅速地强烈激活,同时与吞噬细菌密切相关的清道夫受体(scavenger receptors,SRs)表达量显著升高。首先,通过对绵羊单核巨噬细胞感染沙门氏菌后,转基因绵羊组(transgenic group,Tg)TLR4下游信号通路中吞噬相关基因mRNA水平(SR-A,CD36,Lox-1等)和蛋白磷酸化水平(p38,JNK,ERK,Akt)均显著高于非转基因绵羊组(non-transgenic,NTg)。进一步研究发现,Tg组细胞吞噬、黏附细菌能力均显著高于NTg组,同时参与细胞骨架变化运动的F-actin含量在30min时也显著高于NTg组。随后,通过siRNA干扰技术及添加TLR4特异抑制剂CLI-095后发现,在抑制了 TLR4及TLR4信号转导后,转基因羊单核巨噬细胞的吞噬黏附细菌能力显著降低。最后,为了进一步研究在绵羊单核巨噬细胞中依赖TLR4发生的吞噬细菌作用是由何种信号通路介导的,本研究中分别使用p38,JNK,ERK,PI3K特异性抑制剂抑制其信号转导。最后发现MAPK信号通路及PI3K信号通路都参与到TLR4介导的吞噬细菌过程中。综上所述,本研究发现在绵羊单核巨噬细胞中TLR4通过影响MAPK、PI3K信号通路以及随后激活的F-actin和清道夫受体调节细胞吞噬细菌功能。并发现过表达TLR4转基因绵羊的单核巨噬细胞对沙门氏菌有更强的吞噬能力。本研究丰富了人们对绵羊中TLR4与吞噬细菌机制间联系的认知,同时为转基因抗病育种提供了重要的理论依据及全新的探索。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

图１－１．邋Ｔｏｌｌ样受体在巨噬细胞中的信号转导［２４］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋ＴＬＲ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ逡逑１．１邋ＭｙＤ８８依赖信号通路逡逑ＴＬＲ，ＭＤ８８与白介素受体相关激酶（ＩＲＡＫ）形成复合物Ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ邋［

１邋＃逡逑图１－１．邋Ｔｏｌｌ样受体在巨噬细胞中的信号转导［２４］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋ＴＬＲ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ逡逑１．２．１．１邋ＭｙＤ８８依赖信号通路逡逑在ＴＬＲ的参与下，ＭｙＤ８８与白介素受体相关激酶（ＩＲＡＫ）形成复合物Ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ邋［２５］？逡逑在Ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ形成过程中，ＩＲＡＫ４激活ＩＲＡＫＩ，并在几个位点［２６］进行自发发生a愃峄�后释放逡逑ＭｙＤ８８邋［２７］。ＩＲＡＫＩ与ＴＲＡＦ６结合，随着ＴＲＡＦ６与泛素连接酶ＵＢＣ１３和ＵＥＶＡ１Ａ结合促进逡逑Ｋ６３连接的ＴＲＡＦ６和ＴＡＫ１蛋白激酶复合物多聚泛素化。ＴＡＫ１是促分裂原活化蛋白激酶激酶激逡逑酶（ＭＡＰＫＫＫ）家族中的一员，可以和调节亚基ＴＡＢ〗，ＴＡＢ２，ＴＡＢ３形成复合物［２８，邋２９］。虽逡逑然ＴＡＫｒ激活的的机制尚不清�

本文编号：2752345