高效制备绵羊诱导多能干细胞的研究

发布时间：2020-07-13 06:03

【摘要】：绵羊是一种重要的经济动物,利用转基因技术能快速定向选育优质高产的绵羊新品种。然而传统的转基因技术克隆成功率低,获得的转基因个体常存在发育障碍。基于胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的基因打靶技术能有效提高获得转基因小鼠的效率,但迄今为止,真正的绵羊的ESC很难获得。利用转录因子转导绵羊体细胞建立绵羊的诱导多能干细胞(sheep induced pluripotent stem cell,si PSC)能代替ESC进行基因打靶制备基因修饰绵羊,但目前制备si PSC尚处于起步阶段,诱导效率非常低。因此,寻找一种高效快速诱导si PSC的方法十分迫切。si PSC的获得不仅能用于转基因绵羊的制备,还能为绵羊ESC的培养摸索条件,为探究体细胞重编程机制奠定基础;此外,si PSC在定向分化生殖细胞等功能细胞方面也具有广泛的应用前景。目的:(1)分离三种绵羊体细胞以寻找最佳诱导si PSC的起始细胞,并制备培养si PSC的饲养层细胞;(2)构建p53干扰慢病毒质粒以提高绵羊体细胞重编程的效率;(3)构建ASF1A过表达的慢病毒质粒以提高体绵羊细胞重编程的效率;(4)高效诱导绵羊体细胞为si PSCs;方法:(1)组织块法分离培养妊娠45 d左右的中国美利奴绵羊胎儿成纤维细胞(sheep embryonic fibroblast,SEF)和肾细胞(sheep kidney cell,SKC),全骨髓法分离培养绵羊胎儿骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC);胰酶消化法分离孕12.5 d的CF-1小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),X-射线辐照处理P3代的MEF后冻存,用于培养si PSC;(2)根据Gen Bank数据库中绵羊p53基因的序列,设计干扰p53的短发夹RNA(sh RNA),并克隆至慢病毒干扰载体p Lenti Lox 3.7(p LL3.7),构建干扰绵羊p53基因的慢病毒干扰载体p LL3.7-p53-sh RNA。使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒p LL3.7-p53-sh RNA和p LL3.7空载体及辅助质粒(VSVG、p MDL和REV)后在HEK-293FT细胞中包装慢病毒并测定滴度,以慢病毒MOI=10感染SKC后,利用实时荧光定量PCR和Western blot检测p53干扰效率,进而筛选干扰效率高的干扰片段用于进一步的si PSC诱导;同时,使用实时荧光定量PCR和Western blot检测p21蛋白的表达情况;(3)根据Gen Bank数据库中绿色荧光蛋白EGFP和绵羊ASF1A基因序列,设计扩增EGFP和ASF1A基因的引物序列,分别以p EGFP-N1和绵羊c DNA为模板,扩增EGFP和ASF1A基因,并依次克隆至慢病毒表达载体p LEX-MCS,构建过表达ASF1A的慢病毒载体p LEX-ASF1A-EGFP,并包装过表达ASF1A的慢病毒ASF1A-LV,使用慢病毒EGFP-LV作为阴性对照。于慢病毒感染SKC后不同时间段收集细胞,分别提取细胞总RNA和总蛋白,并将总RNA反转录成c DNA,使用实时荧光定量PCR和Western blot检测ASF1A转录水平和蛋白水平的表达情况;(4)包装8种诱导si PSC的慢病毒(Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4/Lin28/Nanog/Sv40LT/h TERT),测定滴度后,分别以慢病毒MOI=10悬浮感染SEF、SKC和BMSC,感染23天后,利用碱性磷酸酶染色比较三种细胞的重编程效率;选择重编程效率高的体细胞,比较添加p53-sh RNA和ASF1A对重编程效率的影响。所有获得的si PSCs进行AP染色、实时荧光定量PCR、免疫荧光染色、甲基化测序分析、核型分析、拟胚体分化和畸胎瘤形成等方法进行鉴定。结果:(1)成功分离SKC、SEF、BMSC及MEF;经CD44抗体标记鉴定绵羊BMSC阳性率为99.7%;成功制备饲养层细胞;(2)共设计靶向p53的干扰片段4条,并成功构建慢病毒干扰载体;成功包装p53干扰慢病毒p53-sh RNA-LV;使用实时荧光定量PCR和Western blot成功筛选干扰效率高的干扰片段p53-sh RNA-3;同时,干扰p53慢病毒感染SKC后,p53及其下游靶基因p21 m RNA和蛋白的表达水平显著性降低;(3)成功克隆EGFP和ASF1A基因,并成功构建ASF1A过表达的慢病毒表达载体Plex-ASF1A-EGFP;成功包装ASF1A过表达的慢病毒ASF1A-LV;ASF1A-LV感染SKC细胞后显著性增加了ASF1A m RNA和蛋白表达水平;(4)成功利用8种si PSC诱导因子诱导绵羊三种体细胞为si PSC,其中SKC的重编程效率显著高于BMSC和SEF;过表达ASF1A和干扰p53能显著性增加si PSC的形成效率;成功获得si PSC 6株。结论:(1)成功分离和培养了三种绵羊体细胞,为后续建立高效的绵羊诱导多能干细胞提供了实验材料;成功制备饲养层细胞,为后续绵羊诱导多能干细胞的培养提供干细胞培养所必需的营养因子;(2)成功筛选干扰效率高的干扰片段p53-sh RNA-3,并能显著性降低SKC细胞中p53和p21蛋白的表达。(3)成功构建的ASF1A过表达慢病毒能显著增加ASF1A的表达。(4)成功制备了si PSCs;SKC更容易发生体细胞重编程,降低p53基因的表达,增加ASF1A的表达能提高重编程绵羊体细胞的效率。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826

【共引文献】