p53基因影响伪狂犬病毒在小鼠体内复制及致病性的研究
发布时间：2020-07-14 03:28
【摘要】：伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)作为困扰我国养猪业的重要传染病病原之一。20世纪80年代开始,PRV相继地在全国各地爆发,且根据测序结果来看,我国流行的毒株与欧美等国家爆发流行的毒株不同,处于另外一个进化分支。猪一旦感染PRV后,便很难将其从体内清除,造成种猪的终身带毒,仔猪的倒地死亡,打击着我国的农业经济的发展。p53作为动物基因组的“守护者”,扮演着重要角色。p53基因,又称TP53基因,分子量大小约43.7Ku,受基因磷酸化调控。p53定位在猪的第12对染色体中,调控着细胞内各种生物信号的传递。p53基因拥有抗病毒的功能,病毒侵入机体后都能与p53发生相互作用。本研究以小鼠作为动物试验模型,为探索p53在PRV小鼠体内复制和致病性的作用,开展了如下试验:第一部分:PRVgB基因实时定量PCR检测方法的建立首先对本试验用的PRV病毒(Bartha株)的gB基因设计荧光定量PCR专用引物,扩增得到目的基因,并对其回收后T-A连接克隆至pMD19T载体,最后成功构建并鉴定了重组质粒pMD-gB。对构建的重组质粒倍比稀释后,利用SYBR Green染料法荧光定量PCR建立了扩增gB基因的标准曲线,曲线方程为:y=-3.8212x + 41.587、R2=0.9997,标曲的线性关系良好,能作为后续试验检测PRV病毒载量的方法。第二部分:p53影响小鼠体内PRV复制及致病力的研究在对小鼠攻毒前,先对所需的PRV病毒材料进行扩增培养和试验用的p53基因敲除c57BL/6小鼠进行鉴定。然后对野生型(WT)和p53敲除型(p53 KO)小鼠颅内注射1.0X 104TCID50滴度的PRV病毒,然后对两组小鼠做了脑部病毒基因载量和病毒滴度测定试验,存活率试验,组织病理切片的H.E染色观察,炎症因子的mRNA与抗体水平测定,结果发现p53基因的敲除能够降低PRV在小鼠体内的复制,并减弱其致病性。第三部分:PRV感染小鼠后脑组织的全基因转录组差异分析对WT小鼠和p53 KO小鼠攻毒后,收获其脑组织进行小鼠的全基因转录组差异分析,并对16个差异表达的基因采取定量PCR验证,确定了转录组数据的准确性。试验结果发现了 p53 KO小鼠在PRV攻毒后,干扰素相关、趋化因子相关的基因和其他抗病毒相关基因较WT小鼠都呈显著性的下调,并通过WT小鼠的接毒对照试验,说明了 p53 KO小鼠对PRV不易感,进一步验证了第二部分的结果。综上所述,本研究证明了 p53基因的缺失对PRV在小鼠体内复制与致病性起抑制作用。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
１．１．４．邋１邋ＰＲＶ的侵染路径逡逑ＰＲＶ造成宿主病发神经症状后死亡主要是通过两条途径侵入宿主动物的中枢神经逡逑系统如图ｌ－２［５ｎ］所示。两种路径分别由图１－２中黑线和红线表示，二者共同点是都通过逡逑鼻腔为进入口，但随后前者（黑线）通过鼻腔粘膜进入上颉神经后运输到三叉神经，再逡逑经过脑桥漫延感染整个中枢神经系统；后者（红线）则是经嗅觉神经为主干从嗅球、丘逡逑６逡逑
：．：．ｖ；’，．＇栙逡逑２５０ｂｐ邋＾逡逑图２－１邋ｇＢ基因的ＰＣＲ扩增电泳图逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋ｇＢ邋ｇｅｎｅ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ＤＮＡ相对标准分子质量；１：阴性对照；２－３：扩增ｇＢ基因逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋２－３：邋ｇＢ邋ｇｅｎｅ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑２．邋３．２单克隆菌落ＰＣＲ鉴定逡逑ＰＣＲ反应结束后，根据琼脂糖凝胶电泳结果，说明了这７个菌落均成功转化进了连逡逑接好的重组阳性质粒，见图２－２。逡逑Ｍ１２３４５６逦７８逡逑a慑义稀觯龋殄义贤迹玻插澹纾禄虻模校茫壹ㄍ煎义希疲椋珏澹玻插澹遥澹螅酰欤簦箦澹铮驽澹校茫义澹椋洌澹睿簦椋妫椋悖幔簦椋铮铄义希停哄澹模蹋玻埃埃埃模危料喽员曜挤肿又柿浚唬保罚哄危纾禄颍唬福阂跣远哉斟义希停哄澹模蹋玻埃埃板澹模危铃澹停幔颍耄澹颍诲澹保罚哄澹纾洛澹纾澹睿澹诲澹福哄澹危澹纾幔簦椋觯邋澹悖铮睿簦颍
本文编号：2754421
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
１．１．４．邋１邋ＰＲＶ的侵染路径逡逑ＰＲＶ造成宿主病发神经症状后死亡主要是通过两条途径侵入宿主动物的中枢神经逡逑系统如图ｌ－２［５ｎ］所示。两种路径分别由图１－２中黑线和红线表示，二者共同点是都通过逡逑鼻腔为进入口，但随后前者（黑线）通过鼻腔粘膜进入上颉神经后运输到三叉神经，再逡逑经过脑桥漫延感染整个中枢神经系统；后者（红线）则是经嗅觉神经为主干从嗅球、丘逡逑６逡逑
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