结核分枝杆菌RD区诊断标识抗原的筛选及卡介苗突变体库的构建

发布时间：2020-07-14 05:50

【摘要】：结核病(tuberculosis,TB)是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis Complex,MTBC)所引起。据世界卫生组织(WHO)估计,2016年的全球结核病的发病例约为1040万,死亡约130万例。结核病已经成为了单一病原菌致死疾病的首位。近来,WHO制定了“消灭结核病策略”,最终目标在2035年消灭结核病。众所周知,早期的诊断和适当治疗可以预防大多数人死于结核病。因此,亟待需要开发一种高效的结核病诊断方法。基于血清学诊断技术而建立起来的间接ELISA检测、操作简单迅速,且以WHO倡导的无痰样本为检测对象,是结核病诊断技术的研发热点。然而,目前并没有较为理想的商品化ELISA诊断试剂盒,特别是针对肺外结核(EPTB)及早期痰涂片阴性肺结核(PTB-SN)的诊断。因此,开发新的诊断方法潜在策略之一就是筛选新的抗原候选物。本实验从牛分枝杆菌(M.bovis)、卡介苗相对结核分枝杆菌(M.tb)基因组的差异区域入手,对差异区(RD)的129个开放阅读框(ORFs)分别进行克隆和原核表达与纯化,利用临床肺结核(PTB)及肺外结核(EPTB)样本对RD蛋白进行筛选,以期筛选出针对不同类型结核病的新型诊断标识;同时,构建BCG突变体库,从突变库中筛选生物膜成膜能力加强的突变体。主要研究内容和结果如下:(1)RD区基因的克隆、表达与纯化对RD区的129个基因分别进行克隆,选择p ET-32a作为融合载体,经过酶切、连接和测序鉴定,成功构建了78个重组质粒,涉及到除RD12区域外的其他15个RD区的基因。经过IPTG诱导,获得68个表达的蛋白。根据功能注释,数量较多的前5类蛋白为:假想蛋白、噬菌体蛋白、膜/跨膜蛋白、分泌型蛋白、转录调控蛋白。最后对蛋白进行纯化,其中有7个蛋白是可溶性表达,它们分别为Rv0222、Rv0311、Rv1766、Rv1767、Rv1976c、Rv2660c和Rv3120;其他均为非可溶性表达。(2)RD蛋白的初步筛选临床PTB、EPTB标准阳性血清的确定:从武汉市医疗救治中心收集有明显临床症状并确诊的肺结核及肺外结核病人血清,经过实验室建立的人IFN-γ体外2018释放法(IGRA)及TB-DOT商品化试剂盒对临床结核病人血清做进一步检测,选择6份双阳性血清,每3份进行等量混合作为标准阳性血清。标准阴性血清的确定:来自本校的志愿者样本,经过PPD皮试、IGRA法及TB-DOT商品化试剂盒检测,选择6份3种方法检测均阴性的血清,每3份进行等量混合作为标准阴性血清。以OD630阳性血清/OD630阴性血清(P/N)≥2作为初筛标准,用i ELISA方法对68个蛋白分别进行筛选,得到29个蛋白与标准阳性血清有特异性识别反应。其中肺结核组阳性血清筛选到19个抗原,包括Rv3872、Rv3874、Rv3875及Rv1981c等,所在区域分布在RD1-RD4、RD6、RD8、RD10-RD11、RD13、RD15-RD16;肺外结核阳性血清筛选到14个抗原,如Rv3872、Rv1577c、Rv1508c及Rv1514c等,所在区域分布在RD1-RD4、RD6、RD8、RD10、RD13-RD14、RD16。而Rv3872(RD1)、Rv0222(RD4)、Rv0309(RD8)和Rv3403c(RD16)四种抗原被以上2种结核病阳性血清共同筛选到。(3)潜在标识抗原的复筛经过受试者工作曲线(ROC)分析,在PTB组,Rv0222与Rv3403c显示出最高的曲线下面积(AUC)值,分别为0.8247(95%CI,0.7496-0.8997)和0.8223(95%CI,0.7431-0.9015),对应ESAT6/CFP10的AUC值为0.7468(95%CI,0.6576-0.8360)。即Rv0222和Rv3403c在肺结核涂片阳性组(PTB-SP)中表现出最高的诊断能力(83.3%/80%,79.1%/80%),而Rv3403c在PTB-SN中表现出最高的诊断能力(敏感性:70%,特异性:80%)。在EPTB组,Rv0222展示出最高的诊断价值(AUC:0.7706,敏感性:70%,特异性:82.5%),对应ESAT6/CFP10的AUC值为0.7394(95%CI,0.6092-0.8695),敏感性为60%,特异性为70%。且联合Rv0222与Rv3403c蛋白能提高PTB-SN患者的检出率,对应的敏感性特异性分别为86.6%和72.5%。(4)Rv0222与Rv3403c蛋白的免疫学评估Rv0222与Rv3403c蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中抗Rv0222的抗体总Ig G效价为2~(11)×100,同时也测得Ig G1与Ig G2a亚型的效价为2~(12)×100与2~(10)×100;检测抗Rv3403c总抗体Ig G效价为2~(12)×100,Ig G1与Ig G2a亚型的效价同样为2~(12)×100与2~(10)×100。PBS免疫组并未检测到抗体滴度。分离的脾淋巴细胞经Rv0222和Rv3403c刺激后,蛋白免疫组与PBS免疫组的刺激指数有差异(p0.05)。且蛋白免疫组的细胞上清中IFN-γ与TNF-α的浓度高于PBS免疫组,差异极显著(p0.01和p0.001)。(5)卡介苗生物膜相关突变体库的构建用Myco Mar T7转座子系统获得了3170株卡介苗突变体文库,随机挑取1000株突变体进行PCR鉴定,有960株扩增出目的条带,预估转导效率高达96%。进而对鉴定成功的突变体转接到Sauton液体培养基进行成膜能力的初步筛选,其中148株突变体成膜能力较BCG增强。综上所述,来自RD4区的Rv0222和RD16区的Rv3403c均具有潜在的结核病抗体诊断能力,特别在难以诊断的肺外结核、早期的涂阴肺结核的检测灵敏度高于其他候选抗原。且这2个抗原免疫小鼠后,均能诱导高滴度的总Ig G、Ig G1与Ig G2a抗体产生和高浓度IFN-γ和TNF-α的分泌,表明这两个蛋白在小鼠体内能诱导Th1/Th2混合型免疫应答。其中,未知功能蛋白Rv3403c的相关结果为首次报道。此外,构建了卡介苗生物膜相关的突变体文库,为后期研究分枝杆菌生物膜与疫苗的相关性提供了基础。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

结核病发病率

结核分枝杆菌 RD 区诊断标识抗原的筛选及卡介苗生物膜相关突变体库的构建森（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法对菌体进行染色，镜下观察，分枝杆菌染成红色，而其他细菌及背景物质染成蓝色。有研究发现，结核杆菌细胞壁外有一层荚膜的存在，主要成分是多糖与分泌蛋白，这种结构的形成对菌体有一定的保护性，也进一步导致结核杆菌对外在理化因素有较强的抵抗力。60 下 30 分钟便可将 M.tb 杀灭；75%的酒精和紫外线也可将其杀灭(Daffe and Etienne 1999; Stokes et al2004)。

结核分枝杆菌,分枝杆菌,感染谱,细菌形态学

图 1-2 结核分枝杆菌标准株 H37Rv 和牛源临床株 M. tb 1458 基因组图谱Fig.1-2 The whole genomes of M. tb H37Rv and M. tb 14581.2.2 牛分枝杆菌美国学者 Smith 于 1889 年首次从细菌形态学，培养特征和病理学等方面对牛结核病进行了描述；1911 年英国皇家学会称牛源株为牛分枝杆菌（Mcobacteriumbovis, M. bovis），但该名直到 1970 年才通过正式发表而认可(郭爱珍 2015)。M.bovis 是导致牛结核病的主要的病原菌，其感染谱较为广泛，除了感染人与牛外，还可以导致羊、马、狗、猫、鹿、狐、美洲野牛、水牛、野兔等感染结核病。牛分枝杆菌 AF2122/97 株于 1997 年被首次分离，来自于一头肺部、支气管淋巴结发生较为严重干酪样病变的病牛组织中。在 2003 年完成了对牛分枝杆菌AF2122/97 株的全基因组测序，测序结果发现其基因组大小有 4345492bp，G+C含量为 65.63%，含有 3952 个编码蛋白质的基因，一个噬菌体和 42 个插入元件。

结核分枝杆菌复合群,演化过程,分枝杆菌

结核分枝杆菌 RD 区诊断标识抗原的筛选及卡介苗生物膜相关突变体库的构建齿类动物间的流行率为 9-31％，亦可感染人，牛，羊，野生动物等。对田鼠分枝杆菌感染人的病例，最初在免疫力功能受损的人身上分离到，但近些年有报道称，在免疫力正常的结核病患者身上也有分离到此菌 (Frank et al 2009)。在基因组方面，M.microti 相对于结核分枝杆菌，缺失了 RD7、RD8、RD9 和 RD10 区域。羊分枝杆菌（Mycobacterium caprae）首次从一只患有结核病的山羊身上分离得到的，也可感染牛，野猪等。人类结核病的患者中也有羊分枝杆菌分离的报道。在基因组方面，其相对于结核分枝杆菌，缺失区域有 RD5、RD6、RD7、RD8、RD9、RD10、RD12 和 RD13 (Aranaz et al 2003)。总之，结核分枝杆菌复合群（MTBC）是一组高度保守、相关连的分枝杆菌群，由共同的起始菌进化而来，根据各自的宿主偏向性和生物特性进行分类，其进化历程见图 1-3。

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