温湿度指数（THI）介导山羊瘤胃细菌群落的变化

发布时间：2020-07-14 09:19

【摘要】：气候变化是全世界生态系统和畜牧业生产可持续生存的主要威胁之一,而热中性区被认为是反刍动物将新陈代谢和生理调节至正常水平的适当温度范围。温度和湿度过高都将引起动物的细胞和线粒体氧化损伤,温湿度指数(Temperature and Humidity Index,THI)是反映牲畜热应激强度的主要指标。近年来,大多数关于热应激的研究都集中在单胃动物和奶牛身上,而波尔山羊作为一种理想的肉用山羊品种,其生产性能与繁殖性能的发挥与所处环境温湿度直接相关,因此研究热应激对其的影响具有重要的现实意义。瘤胃是反刍动物独有的器官,其中含有大量的微生物,在维持宿主正常消化和吸收方面发挥重要作用。高通量测序是近年新兴的检测技术,深度测序可以通过有效的空间和时间视图获得微生物群落的生物信息,且PICRUSt可以仅基于16S扩增子测序数据,而不需要全部的基因组来预测微生物功能。因此,本研究旨在利用16S扩增子测序等技术检测热应激对山羊瘤胃pH、挥发性脂肪酸(Volatile Fatty Acid,VFA)和微生物组的不利影响。本研究选择健康状况良好的8只雌性山羊(波尔×关中奶山羊,18月龄,32.8±3.4kg),随机分为2组,分配至2个代谢仓A和B(代谢仓位于陕西杨凌的西北农林科技大学试验站,室内温度和湿度可精确控制,精确度偏差为±0.5°C和±5%,4只山羊/仓)。以23°C,50%为初始温湿度(预饲30天),在第30天时将A仓设为对照组(CK),之后设定4组温度(26°C,30°C,34°C,38°C)和4组相对湿度(35%,50%,65%,80%),采用完全随机设计计算出16个温湿度指数(THIs),每个处理进行5天,各处理之间无时间间隔。通过口腔插管收集瘤胃液样品,测定pH后分离5 mL样品储存于-20°C以备后续VFA检测,其余样品提取DNA后,部分采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)检测瘤胃微生物含量,部分在16个逐渐增加的温湿度指数(TH1~TH16)下利用高通量测序技术检测瘤胃细菌群落的动态变化。结果表明:(1)热应激显著提高了pH、乙酸比例、乙丙比(P0.05),降低了总挥发性脂肪酸含量与丁酸、戊酸比例(P0.05),但对丙酸、异丁酸、异戊酸比例影响不显著。(2)通过qPCR检测,发现热应激显著改变了原虫、产甲烷菌、Fibrobacter succinogenes和Ruminococcus flavefaciens的数量,但对总细菌含量无显著影响。(3)外界温湿环境变化对山羊瘤胃菌群α多样性(Ace、Chao 1、Shannon、Simpson等)没有显著影响,但显著改变了山羊瘤胃微生物群的主要门和属结构。随着THI增大,Firmicutes丰度降低(从67.09%至27.21%),Bacteroidetes丰度增加(从19.41%至65.55%),两个门之间呈负相关。在属水平上,Prevotella_1丰度均最丰富,且高TH组含量更多。随着THI的增加,部分益生菌含量下降,致病菌丰度增加。同时,TH组与CK组之间聚类不同,高TH组与低TH组分别聚类,且从TH7到TH9时(THI从80.61到82.92)瘤胃细菌群落改变明显。(4)利用PICRUSt来预测细菌功能,预测结果显示,随THI升高,碳水化合物和能量代谢显著改变(P0.05)。通过对菌门与代谢途径进行相关分析发现,菌群中Firmicutes丰度与氨基糖和核苷酸糖代谢呈负相关(r=-0.432,P0.01)。Bacteroidetes丰度与嘌呤代谢呈正相关(r=0.412,P0.01),但与ABC转运蛋白(r=-0.455,P0.01)和氨酰-tRNA生物合成呈负相关(r=-0.417,P0.01)。综上所述,环境THI的改变能显著影响山羊pH、VFA和瘤胃微生物的种类和多样性,不同指标之间也存在一定的关联。THI增大时会增加山羊瘤胃的致病菌而减少益生菌,且当THI从80.61增大到82.92时细菌组成变化大。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S827
【图文】：

曲线,样本,单元,曲线

图 3-1 不同 THI 样本基于操作分类单元（OTU）（3%差异）的稀释性曲线Rarefaction analyses based on the operational taxonomic units (OTUs) (3% divedifferent THI samples.表 3-2 不同处理比对至 16S rRNA 基因数据库后的 OTU 的数量与样本多样umber of OTUs, estimated sample diversity aligning the 16S rRNAgene databatreatments.ACE Chao 1 Shannon Simpson OTU 687.88±142.36 707.83±147.81 3.65±0.66 0.09±0.07 517.33±103.27775.70±55.27 784.14±42.48 3.91±0.50 0.06±0.03 527.67±78.62 738.55±75.15 749.12±70.14 3.40±0.64 0.14±0.12 515.33±40.08 691.60±106.81 701.11±90.36 3.44±0.78 0.10±0.08 504.00±96.97 804.88±108.26 811.95±113.39 4.04±0.33 0.05±0.02 595.00±79.05 715.51±149.28 708.60±138.67 3.86±0.55 0.07±0.04 534.00±100.37811.46±138.59 815.53±133.17 4.41±0.18 0.03±0.01 622.00±93.26 696.89±130.69 707.80±151.18 4.14±0.19 0.04±0.01 540.33±87.23 790.86±86.19 792.52±83.22 4.43±0.09 0.03±0.00 599.00±16.37

瘤胃细菌,群落,细菌,相对丰度

26图 3-2 a.门水平上的瘤胃细菌群落。面积堆积图显示了 THI 组中相对细菌在门水平的分布。b.不同 THI 组间最主要的属（相对丰度小于 2％的进行合并）。c. 热图表示不同 THI 组间与热应激相关的前 50 个属的相对百分比;基于 Minkowski 距离沿 X 轴的 THI 组和沿 Y 轴的细菌属进行分层聚类。不同颜色代表每个 THI 组中属的相对丰度。颜色强度越强，属的相对值越大，蓝色表示没有代表性细菌。Figure. 3-2 a. Rumen bacterial communities at the phylum level.An acreage plot shows the distributions of the relative bacterial phyla across the THI groups. b.Distribution of the most dominant genera across different THI groups (those with a relative abundance of less than 2% were combined). c. The heatmap representsthe relative percentage of the top 50 genera associated with heat stress across different THI groups; Hierarchical clustering was based on the Minkowski distance ofthe THI groups along the X-axis and the bacterial genera along the Y-axis, respectively. Color represented the relative abundance of genera in each THI group. Thestronger the color intensity, the greater the relative value of genus, and blue indicates that there are no representative bacteria.

丰度,相关分析,瘤胃细菌,湿度

高 THI 组聚为另一部分。使用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）能有效地区分 THI 组之间的观察结果（图3-4c）。结果表明，不同分组下组内样本个体聚集在一起而组间差异不大，特别是在 THI较低时。然而，高 THI 组和低 THI 组之间存在较大的差异，并且随着 THI 的增加，差异越大。此外，相同温度或相同湿度下组内也存在明显的聚类，而组间具有很大区分（图 3-4d,f）。在只考虑温度或湿度的影响时，结果表明了与低温（26°C 和 30°C）相比，在高温（34°C 和 38°C）下，湿度对瘤胃细菌组成的影响发挥着更大的作用。然而，在高湿度和低湿度环境下，温度对瘤胃微生物组的影响较为一致（图 3-5a-h）。3.2.5 预测瘤胃细菌功能与分子途径通过对相关 OTU 使用 PICRUSt 分析

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