KDM4D和KDM4E在牛受精胚胎发育和体细胞核移植胚胎重编程过程中的作用研究
发布时间：2020-07-14 13:38
【摘要】：体细胞核移植(SCNT)技术可使高度分化的体细胞通过重编程获得全能性,从而发育成新的动物个体。该技术在治疗性克隆生产、疾病模型建立、再生医药制造、家畜性状改良、濒危物种保护等方面的应用潜力巨大。但长期以来,利用SCNT技术生产克隆动物的效率极低,主要表现在胚胎早期发育的高损率、克隆动物在孕期或围产期死亡、克隆动物出生后的发育异常等方面,这严重阻碍着该技术的推广应用。当前广泛认为,供体细胞基因组上的表观遗传修饰未能被卵胞质充分地重编程是导致克隆效率低下的主要原因。研究表明,牛SCNT胚胎在合子基因组激活(ZGA)时期存在异常高水平的组蛋白H3第九位赖氨酸残基三甲基化(H3K9me3)和二甲基化(H3K9me2)修饰,猜测这两种表观标记是导致牛SCNT重编程不充分的障碍之一。本研究通过转录组测序(RNA-seq)和实时荧光定量PCR(qPCR)实验,首次确认了造成上述异常修饰的两个组蛋白H3K9去甲基化酶——KDM4D和KDM4E。通过胚胎显微注射技术,在牛体外受精(IVF)胚胎中干扰KDM4D和KDM4E基因表达,而在SCNT胚胎中过表达KDM4D和KDM4E,以此研究这两个因子在受精胚胎正常发育和SCNT胚胎重编程过程中的作用。主要的实验内容和结果如下:1.通过RNA-seq数据和qPCR实验,确定了牛IVF与SCNT胚胎中KDM4D和KDM4E基因表达量的变化模式。结果显示这两个基因在两类胚胎中均呈现ZGA时期一过性高表达的转录情况,并且KDM4E的表达量高于KDM4D,而SCNT胚胎中这两个基因的表达量均显著低于同时期的IVF胚胎。2.通过干扰片段的显微注射实验,研究沉默KDM4D和KDM4E基因的表达对IVF胚胎发育的影响。结果发现,同时干扰这两个基因会显著抑制IVF胚胎ZGA阶段H3K9甲基化的抹除,影响卫星序列satellite I和部分合子基因的转录激活,并损害了胚胎的体外发育能力,表现在囊胚发育率低下、囊胚细胞数下降和囊胚凋亡水平上升等方面。而单独沉默KDM4D或KDM4E的差异结果表明,KDM4E对牛受精胚胎的发育发挥着更重要的作用。3.通过KDM4D和KDM4E mRNA的显微注射实验,研究过表达野生型和功能缺失突变型KDM4D或KDM4E对SCNT胚胎发育的影响。结果发现,过表达野生型的KDM4D或KDM4E均会高效去除SCNT胚胎ZGA阶段的H3K9甲基化标记,恢复卫星序列satellite I和部分合子基因的转录激活,并改进胚胎体外和体内的发育能力,表现在囊胚发育率提高、囊胚内细胞团细胞数增多和促进克隆牛出生等方面,但过表达突变型的KDM4D或KDM4E并不会改善SCNT胚胎的发育。4.通过RNA-seq数据,确定8细胞期牛IVF和SCNT胚胎的差异表达基因(DEGs),以及在SCNT胚胎中过表达KDM4E对这些DEGs的调整情况。结果在6,948个上述DEGs中,有1,893个SCNT胚胎低表达的基因可被过表达的KDM4E再次激活,这类DEGs主要参与信号转导、胚胎发育、细胞周期和基因表达调控等生物过程,以及紧密连接、干性因子、蛋白泛素化和Hippo信号等细胞通路。同时,过表达KDM4E使2,057个SCNT胚胎高表达基因的转录水平得到调整。这类DEGs主要参与氧化还原稳态、蛋白甲基化修饰和DNA损伤应答等生物过程,以及氧化磷酸化、蛋白及RNA降解和RNA转录等细胞通路。综上所述,本研究一方面证明了牛IVF胚胎ZGA时期H3K9me3和H3K9me2修饰的抹除由同时期高表达的KDM4D和KDM4E调控,干扰这两个因子的表达不利于IVF胚胎的发育。另一方面证实了牛SCNT胚胎ZGA时期异常高的H3K9me3和H3K9me2修饰与其内源低表达的KDM4D和KDM4E有关,过表达这两个因子促进了SCNT介导的体细胞重编程,并提高了克隆牛的生产效率。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【图文】：
图 1 1 多种模式动物的合子基因组激活时期(Tadros et al. 2009)Fig. 1 1 Timing of zygotic genome activation in several model organisms椎动物中，按细胞周期来说，小鼠胚胎具有最早的 ZGA 起始时期 2 细胞期（第 2 d，第 1 细胞周期）激活～800 个基因和～3,500 个 和主波 ZGA(Hamatani et al. 2004; Xue et al. 2013)。相比之下，其波 ZGA 的启动更滞后。人胚胎的次波 ZGA 发生在 2 4 细胞期（第 ），激活～1,000 个基因，主波 ZGA 发生在 4 8 细胞期（第 3 d，第～2,500 个基因(Yan et al. 2013)。大鼠(Whitworth et al. 2004)、猴子2
下内容根据已有的研究情况，对这些调控机制进行归纳和阐述。基因组激活的机制 的启动有四种常见模型，一是核质比模型（图 1 2A），主要认为早期核相对胞质的体积占比增高，同时胞质中的 ZGA 抑制因子（红色），低于一定阈值便会启动合子基因转录(Newport et al. 1982a; New二是母源钟模型（图 1 2B），主要认为 ZGA 的启动时间由不依赖于子（绿色）决定，这些因子达到一定数量或活性便会启动合子基因转录)。三是遗传物质模型（图 1 2C），主要认为具有充足激活因子（蓝色NA 模板达到一定数量和表观开放程度才能开启合子基因的表达(Li e al. 2014b)。四是细胞周期模型（图 1 2D），是早期卵裂迅速的物种特要认为早期卵裂的短细胞周期不利于合子基因转录，细胞周期延长后llart et al. 2013; De Renzis et al. 2007)。下文将从以下四个方面揭示胚机制：（1）细胞周期和核质比调控；（2）染色体结构调整；（3）转录子；（4）与母源物质清除的关系。
1 4 通过 RNA-seq 确定牛胚胎中合子基因的不同策略(Graf et al. 2C）（E）胚胎发育各时期三个基因的测序读值在参考基因组的分（B）（D）（F）胚胎发育各时期三个基因的测序表达量。rent strategies for fine mapping of genome activation in bovine embryds distribution on the reference genome of three genes at the different ) (D) (F) Expression levels of three genes at the different embryonic st为详实地总结了不同物种 ZGA 的发生时间、参与机制一进程对其他延伸学科的发展意义巨大，包括表观遗传、体细胞诱导 iPSCs 和体细胞克隆重编程等等。尽管动和 ZGA 启动是相对保守的，但不同物种之间的具体情况控现象的相互反馈机制还知之甚少，期待未来不久会有
本文编号：2755041
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【图文】：
图 1 1 多种模式动物的合子基因组激活时期(Tadros et al. 2009)Fig. 1 1 Timing of zygotic genome activation in several model organisms椎动物中，按细胞周期来说，小鼠胚胎具有最早的 ZGA 起始时期 2 细胞期（第 2 d，第 1 细胞周期）激活～800 个基因和～3,500 个 和主波 ZGA(Hamatani et al. 2004; Xue et al. 2013)。相比之下，其波 ZGA 的启动更滞后。人胚胎的次波 ZGA 发生在 2 4 细胞期（第 ），激活～1,000 个基因，主波 ZGA 发生在 4 8 细胞期（第 3 d，第～2,500 个基因(Yan et al. 2013)。大鼠(Whitworth et al. 2004)、猴子2
下内容根据已有的研究情况，对这些调控机制进行归纳和阐述。基因组激活的机制 的启动有四种常见模型，一是核质比模型（图 1 2A），主要认为早期核相对胞质的体积占比增高，同时胞质中的 ZGA 抑制因子（红色），低于一定阈值便会启动合子基因转录(Newport et al. 1982a; New二是母源钟模型（图 1 2B），主要认为 ZGA 的启动时间由不依赖于子（绿色）决定，这些因子达到一定数量或活性便会启动合子基因转录)。三是遗传物质模型（图 1 2C），主要认为具有充足激活因子（蓝色NA 模板达到一定数量和表观开放程度才能开启合子基因的表达(Li e al. 2014b)。四是细胞周期模型（图 1 2D），是早期卵裂迅速的物种特要认为早期卵裂的短细胞周期不利于合子基因转录，细胞周期延长后llart et al. 2013; De Renzis et al. 2007)。下文将从以下四个方面揭示胚机制：（1）细胞周期和核质比调控；（2）染色体结构调整；（3）转录子；（4）与母源物质清除的关系。
1 4 通过 RNA-seq 确定牛胚胎中合子基因的不同策略(Graf et al. 2C）（E）胚胎发育各时期三个基因的测序读值在参考基因组的分（B）（D）（F）胚胎发育各时期三个基因的测序表达量。rent strategies for fine mapping of genome activation in bovine embryds distribution on the reference genome of three genes at the different ) (D) (F) Expression levels of three genes at the different embryonic st为详实地总结了不同物种 ZGA 的发生时间、参与机制一进程对其他延伸学科的发展意义巨大，包括表观遗传、体细胞诱导 iPSCs 和体细胞克隆重编程等等。尽管动和 ZGA 启动是相对保守的，但不同物种之间的具体情况控现象的相互反馈机制还知之甚少，期待未来不久会有
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