布鲁氏菌VirB12的重组表达及其用于标记疫苗细胞免疫鉴别研究

发布时间：2020-07-14 22:08

【摘要】：研究背景:布鲁氏菌病(简称布病)是一种严重危害畜牧业的人兽共患病,动物布病主要依赖疫苗免疫来预防和控制。目前,国内疫苗株主要有3种,分别是S2(主要用于猪布鲁氏防疫)、A19(用于牛布鲁氏防疫)、M5-90(用于绵羊布鲁氏防疫)。这些疫苗在预防和控制动物布鲁氏菌传播中发挥了重要作用。在这些疫苗的实际应用中,也存在一些问题。而血清学监测是动物布病诊断最主要的技术手段,主要有常用的虎红平板凝集、试管凝集等方法,但是这些方法无法区分哪些是自然感染抗体,哪些是免疫抗体,给防疫工作的开展带来很大困难。基因标记疫苗被认为是解决布病疫苗免疫与自然感染鉴别诊断难题的新型疫苗形式。由天康生物股份有限公司研发的A19-ΔVirB12基因标记疫苗,其毒力与母本株相比降低,具有良好的保护作用。利用VirB12蛋白能够进行血清学诊断。本研究旨在通过体外重组表达VirB12蛋白,分析VirB12蛋白的细胞免疫特性,并探讨其在疫苗免疫与自然感染中鉴别的可行性。研究方法:提取细菌基因组DNA,根据NCBI上登录的布鲁氏菌A19菌株virB12基因序列,使用分子生物学软件prime premier 5.0设计并合成了1对扩增virB12基因的引物。利用PCR方法扩增出virB12基因,并克隆到pET-28a质粒载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱纯化,并对纯化后的表达产物进行免疫印迹鉴定。布鲁氏菌A19-ΔVirB12菌株与亲本株布鲁氏菌A19株及牛种强毒2308株相比缺少了virB12基因,A19-ΔVirB12菌株在生长过程中不表达对应的VirB12蛋白,动物在免疫接种后无法产生VirB12抗体及对应的免疫记忆,本实验通过体外提取A19菌株和A19-ΔVirB12菌株免疫后试验动物的外周血淋巴细胞,培养后用VirB12蛋白作为抗原刺激淋巴细胞,然后检测IFN-γ,对A19菌株和A19-ΔVirB12菌株进行免疫鉴别。研究结果:本试验成功构建了布鲁氏菌A19菌株virB12基因的原核表达载体,诱导表达的VirB12蛋白经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白,免疫印记试验显示该重组蛋白有较好的反应原性,与布鲁氏菌野毒阳性血清有反应,与A19-ΔVirB12菌株免疫血清无反应。采用纯化的VirB12蛋白进行的体外IFN-γ检测,结果显示,A19菌株免疫组与A19-ΔVirB12菌株免疫组的外周血淋巴细胞(PBMC)经VirB12刺激后产生的IFN-γ存在显著差异(P0.001),表明通过这种体外PBMC细胞提取及VirB12蛋白刺激可以鉴别区分A19菌株与A19-ΔVirB12菌株免疫。结论:本研究成功构建了VirB12蛋白的原核表达菌株,经纯化后的VirB12蛋白可以作为刺激抗原,在体外IFN-γ水平上可实现对A19菌株免疫与A19-ΔVirB12菌株免疫进行区分,为布氏菌病的防控及净化提供新的方法和思路。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

PCR扩增,基因,脱色液,暗室

放置在摇床上，用 TBST 清洗毒感染牛的阳性血清和 A19-ΔVirB1箱孵育 1 h，取出后，按上述方法继HRP 标记的蛋白 G 作为二抗也加入抗相同。最后向放于小平皿中的 NC暗室显色，发现条带后用脱色液冲洗％琼脂糖凝胶电泳分析产物，500bp目的片段 519bp 相符（图 1）。此结

质粒,沈阳农业大学,硕士学位论文,双酶

沈阳农业大学硕士学位论文：DL5000；1：阴性对照；2~3:PCR 扩Figure 1 PCR amplification of virB12 g；1:Negative control；2~3：Amplificati的鉴定 pET-28a 质粒经 BamHⅠ和 SalⅠ双酶菌 BL21（DE3）于 37℃恒温箱培 BamHⅠ、SalⅠ双酶切鉴定。结果显p 的特异性条带（图 2），说明布鲁菌落为阳性克隆。然后将质粒送宝氏菌 A19 菌株 virB12 基因序列。

基因测序,结果分析,菌体

图 3 virB12 基因测序结果分析Figure 3 Analysis of virB12 sequencing results的诱导表达和 SDS-PAGE 电泳鉴定VirB12 重组表达菌接种于 4mL 含 Kan(50μg/mL）的当其 OD600约为 0.4～0.6 时，加入 IPTG 至终浓度离心收集菌体沉淀。在收集的菌体沉淀中加入 SDS匀后煮沸裂解 10 分钟，进行 SDS-PAGE 电泳。SD测到大小约为 22KDa 蛋白表达条带，与预期一致表达（图 4）。

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