内脂素在LPS诱导的肠黏膜损伤及炎症反应中的作用

发布时间：2020-07-14 22:10

【摘要】：内脂素(Visfatin)作为一种新型蛋白同时也是一种多功能蛋白,具有和前B细胞克隆增强因子(PBEF)相同的蛋白结构,与烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)有同样的酶活性,能通过调节氧化型辅酶l(NAD)的生成参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程,并且参与免疫和炎症的调节。肠黏膜屏障是机体防御外界病原微生物入侵的第一道防线,在机体生长发育过程中发挥关键作用。研究表明,肠黏膜炎症疾病中有大量内脂素的表达,推测内脂素作为炎性介质可能参与肠黏膜损伤的过程,从而影响肠黏膜屏障。因此,本试验首先选用昆明小鼠,腹腔注射LPS诱导肠黏膜损伤,采用HE染色、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR、Western blot和ELISA等技术方法研究内脂素在LPS引起的肠黏膜损伤中的作用及参与的信号通路;其次,通过沉默TLR4、TLR2或IL-1R1等基因研究其对体外免疫炎症反应中内脂素表达的影响,探讨内脂素参与免疫炎症反应的应答方式,以明确内脂素在LPS介导免疫炎症反应中的作用机制。具体研究结果如下:1肠黏膜损伤对小鼠回肠组织结构以及内脂素表达的影响本试验取LPS诱导小鼠肠黏膜损伤后淋巴组织较多的回肠作为试验材料,HE染色结果显示,对照组(生理盐水组)小鼠回肠结构完整,肠绒毛长度较长,V/C值(小肠消化吸收功能和机体健康状况的重要指标)大;与对照组相比,LPS组回肠组织损伤明显,杯状细胞增加,肠绒毛固有层水肿,浆膜层结构疏松,黏膜下层疏松,可见炎性细胞浸润,V/C值明显降低。免疫组化和q-PCR结果显示:对照组小鼠内脂素主要表达在肠隐窝,部分在肠绒毛固有层;LPS组的回肠中,内脂素主要在肠隐窝分布,并且在肠绒毛固有层中的分布增加,内脂素的转录水平明显增强(P0.001)。以上结果说明,LPS刺激可以破坏回肠结构,肠黏膜损伤,影响肠道消化吸收能力,促进内脂素表达。2内脂素对肠黏膜损伤中回肠肠黏膜屏障的影响ZO-1、sIgA、Claudin-1和VEGF作为肠黏膜屏障的重要组分,在肠黏膜屏障的结构的完整和功能的发挥上有关键作用。紧密连接蛋白包括ZO-1和Claudin-1。ZO-1主要分布在肠绒毛上皮细胞,表达量多,少量表达在肠隐窝,在LPS刺激后,表达明显减少(P0.01),与LPS组相比,LPS+Visfatin组ZO-1的mRNA和蛋白的表达均增加。q-PCR检测LPS组Claudin-1的表达比对照组显著多(P0.001),与LPS组相比,LPS+Visfatin组Claudin-1表达呈现下降趋势(P0.001)。分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和血管内皮生长因子(VEGF)可维持肠黏膜屏障的稳定。sIgA主要分布在肠腺及肠黏膜固有层,表达量高,LPS作用后的肠黏膜损伤组的sIgA在肠绒毛固有层减少明显,表达量明显减少,与LPS组相比,LPS+Visfatin组表达量上升明显,且差异极显著(P0.01)。VEGF主要表达在肠隐窝,肠绒毛固有层的中央乳糜管少量分布,表达水平低,而LPS组VEGF的表达明显增强(P0.0001);与LPS组相比,LPS+Visfatin组回肠中VEGF在肠绒毛的表达明显减少(P0.05)。以上结果表明,LPS刺激后显著抑制回肠ZO-1和sIgA表达,上调Claudin-1和VEGF,破坏肠黏膜屏障造成肠黏膜损伤,而外源性内脂素能促进ZO-1和sIgA表达,下调Claudin-1和VEGF,降低肠黏膜屏障的破坏程度。3内脂素对肠黏膜损伤中相关信号通路的影响通过对前期RNA-seq的数据进行分析,发现IκBα、TLR8、TICAM-1和NOD2等基因与肠黏膜免疫相关并且富集在TLR信号通路及NLR信号通路。因此,本试验选取了TLR信号通路和NLR信号通路以及抗原呈递信号通路中四个关键基因进行荧光定量PCR验证,两个关键因子进行蛋白水平检验。结果显示TLR4在LPS组比对照组明显增加(P0.0001),与LPS组比较,LPS+Visfatin组显著下降(P0.05)。TICAM-1和IκBα的表达变化TLR4一致。H2-Q10在Saline组、LPS组和LPS+Visfatin组保持上升趋势,H2-Q10在LPS组明显高于Saline组(P0.01)。Western Blot技术和ELISA结果显示:与Saline组比,NOD2在LPS组表达上升,跟LPS组比,LPS+Visfatin组NOD2下降;TLR8的变化趋势与NOD2一致。表明:LPS作用后,激活天然免疫信号通路,促进炎症反应,诱导肠黏膜损伤;内脂素的添加抑制了TLR4、TICAM-1、IκBα、NOD2和TLR8的高表达,能参与TLR和NLR信号通路的调节,其中主要通过TLR4的调节,参与TLR信号通路,降低回肠炎症反应,维持肠道稳态。4 TLR4、TLR2和IL-1R1基因沉默对体外炎症反应中内脂素的影响本试验首先利用RNA干扰技术探究TLR4、TLR2和IL-1R1对内脂素表达的影响,通过q-PCR检测发现TLR4-230、TLR2-519和IL1R1-1904可作为沉默TLR4、TLR2和IL-1R1基因表达的最佳干扰序列,siRNA作用浓度为45nM,LPS作用浓度为500ng/ml时,与ControlsiRNA+LPS组比,TLR4siRNA+LPS组、TLR2siRNA+LPS组以及IL-1R1siRNA+LPS组内脂素的表达均下调(P0.01),此外,还检测了TLR4、TLR2和IL-1R1siRNA转染RAW264.7细胞24h后,LPS分别处理3h,6h和12h后,内脂素表达的动态变化。Western Blot检测结果显示:LPS刺激6h和12h,与ControlsiRNA+LPS组相比,TLR2siRNA+LPS组和IL-1R1siRNA+LPS组内脂素均降低,且差异显著(P0.05),而TLR4siRNA+LPS组的内脂素的表达有下降趋势,但是差异不显著(P0.05)。结果表明,LPS刺激后能通过调控TLR4、TLR2和IL-1R1的表达从而影响内脂素的表达,其中TLR2和IL-1R1对内脂素表达调控起主要作用,提示先天免疫系统的信号传导途径对细胞中内脂素的表达具有强调节作用。5 TLR4、TLR2和IL1R1基因沉默对各炎症因子表达的影响siRNA转染后,LPS刺激RAW264.7细胞3h、6h和12h,ELISA检测培养基上清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的表达。结果显示:与ControlsiRNA+LPS组相比,TLR4siRNA+LPS、TLR2siRNA+LPS和IL-1R1siRNA+LPS组的TNF-α和IL-6、IL-1β和MCP-1的蛋白水平显著下降,其中TLR4siRNA、TLR2siRNA和IL-1R1siRNA在LPS刺激6h时均下调TNF-α,差异极显著(P0.01),在LPS刺激12h时均显著下调IL-6的表达(P0.01),LPS作用6h以及12h均能下调IL-1β(P0.05),在LPS刺激3h时极显著的下调MCP-1表达(P0.01)。而TLR2siRNA和IL-1R1siRNA在LPS刺激6h和12h时,同样抑制内脂素的表达,且差异显著(P0.05)。以上结果说明,LPS刺激时,沉默TLR4、TLR2和IL-1R1同样会引起炎症因子的表达下降,进一步说明LPS介导的炎症反应中,内脂素的表达与TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子表达有关,通过调控上述因子的表达来参与应答反应。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.3
【图文】：

内脂,血糖浓度

诱导的死亡(Pillai et al 2005)。NAD 的增加对轴突病变和神经变性为特征的疾病可以作为靶标(Araki et al 2004)，意味着内脂素的适度表达也应具有强大的神经保护作用。内脂素发挥胰岛素样的作用，脂肪组织中内脂素基因的表达与促炎基因和代谢表型的具有重要关联。有研究表明，在细胞培养过程中，内脂素与胰岛素受体结合并激活胰岛素受体，能够发挥与胰岛素相同的作用，下调小鼠的血糖水平，因此深入研究内脂素生理功能可能会对血糖稳态或代谢紊乱的新疗法开辟新的思路(Fukuhara et al 2005)。而后又发现，内脏脂肪组织（VAT）和皮下脂肪组织（SAT）中内脂素的 mRNA 水平与血糖浓度呈正相关，测量数据分别为 r = 0.42，P = 0.03 和r = 0.44，P = 0.03(Chang et al 2010)。说明内脂素不仅参与血糖调节，还与血糖浓度呈正相关。另一方面，内脏脂肪组织的内脂素转录水平与甘油三酯（r = 0.42，P =0.002）和总胆固醇水平（r = 0.37，P = .009）呈正相关，提示内脂素参与脂肪代谢(Chang et al 2010)。

小鼠,肠绒毛,生理盐水,长度

华中农业大学 2019 届硕士研究生学位（毕业）论文2 结果2.1 LPS 诱导的炎症反应对小鼠回肠结构的影响2.1.1 LPS 致小鼠回肠组织结构的病理学变化HE 染色结果显示，生理盐水对照组小鼠回肠结构完整、清晰，无炎性细胞浸润，无水肿，肠绒毛长度较长；LPS 组回肠组织损伤明显，肠绒毛长度降低，肠绒毛固有层水肿，黏膜下层疏松，浆膜层结构疏松，可见炎性细胞浸润。肠绒毛长度和肠隐窝深度的比值（V/C 值）采用 IPP 软件测量各试验组回肠肠绒毛长度（V）和肠隐窝深度（C），计算 V/C 值，结果显示，在生理盐水对照组小鼠回肠的 V/C值较大，与生理盐水对照组相比，LPS 组的 V/C 值降低，差异极显著（P<0.001）。

位置分布,内脂,小鼠,肠黏膜屏障

图 2. 不同组小鼠回肠内脂素的表达Fig. 2. The expression of visfatin in different groups of mouse ilum tissues注：A：内脂素位置分布，B：内脂素 mRNA 水平和积分光密度（IOD 值）红色箭头所指为内脂素阳性信号的分布；差异极显著***P<0.001.Note: A: the distribution of visfatin B: the mRNA level and IOD values of visfatinRed arrow refer to the distribution of visfatin; the difference was highly significant, ***P<0.001.内脂素对 LPS 诱导的小鼠肠黏膜屏障的影响1 不同试验组肠黏膜屏障相关蛋白表达水平的变化紧密连接蛋白 ZO-1，Claudin-1 和分泌型免疫球蛋白 A（sIgA）等是肠道要组分，能够阻止毒性大分子及微生物入侵，增强肠黏膜的屏障功能。免疫组化结果显示，对照组中 ZO-1 表达量较多，主要分布在肠绒毛上皮细

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