我国欧洲型PRRSV的流行病学调查与单克隆抗体的制备

发布时间：2020-07-15 20:18

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的母猪流产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪呼吸障碍症状的疾病。PRRSV可分为2个基因型,分别是以欧洲Lelystad virus毒株为代表的欧洲型(基因1型)和以美洲VR-2332为代表的美洲型(基因2型)。目前,国内有关欧洲型PRRSV流行病学研究较少,为了了解欧洲型PRRSV在中国的流行情况,加强对欧洲型PRRSV的监测十分重要。2016~2018年,本研究从全国350份疑似PRRSV感染的病料中检测到5株欧洲型PRRSV,并命名为ZD1株、WK14株、WK141株、WG9株和HN7株。对这5株病毒进行了全基因组序列分析及遗传演化分析。核苷酸比对结果显示,与美洲型参考株VR2332的全基因组核苷酸同源性为60.0%~60.4%,与欧洲型参考株Lelystad virus毒株核苷酸同源性为88.3%~88.9%。ZD1、WG9、HN7株与LNEU12株的核苷酸同源性最高分别为93.5%、93.3%、93.2%,WK14株与BJEU06-1核苷酸同源性最高为89.7%,WK141与NVDC-NM3核苷酸同源性最高为93.5%。Nsp2、ORF3和ORF4推导aa序列比对结果表明,本研究中ZD1株的ORF3提前26个aa终止,另外WK14、WK141、WG9和HN7株在ORF3的246位存在1个aa的缺失;WK14、WK141、WG9、HN7和ZD1株PRRSV在ORF4的66位皆存在1个aa的缺失;此外,这5株欧洲型PRRSV在Nsp2的357~360和411位分别存在4+1个aa的缺失。这种缺失或提前终止增加了欧洲型PRRSV的变异程度,然而这种变化对PRRSV生物学特性的影响尚不清楚。重组是造成PRRSV变异的主要原因之一,关于美洲型PRRSV发生重组的报道屡见不鲜,但目前为止关于欧洲型PRRSV重组现象的报道较少。重组分析表明,本研究分离的5株欧洲型PRRSV中,WK14是BJEU06-1和NVDC-FJ的重组病毒,重组区域位于第951~3251位碱基处;WK141是NVDCNM1-2011和HENZMD-10的重组病毒,重组区域位于7131~9111位碱基处。这种重组现象在欧洲型PRRSV中出现较少的原因比较复杂,推测可能与这类病毒株的特性有关。目前国内针对PRRSV抗体检测方法大多是针对N蛋白,但是欧洲型和美洲型PRRSV N蛋白血清抗体有交叉反应,无法通过检测抗体来判断欧洲型PRRSV在中国的流行情况,因此建立针对欧洲型PRRSV特异性抗体检测方法有十分重要的意义。本研究以超离纯化的PRRSV ZD1全病毒作为免疫原免疫小鼠,成功制备2株杂交瘤细胞株2C5和2C6。亚型鉴定表明,杂交瘤细胞2C5和2C6分泌的单克隆抗体重链均属于IgG2a亚类,轻链为kappa链。杂交瘤细胞2C5和2C6培养上清和制备的腹水中抗体的IFA效价分别为1:320,1:16000和1:320,1:8000。IFA试验表明2C5和2C6能区分欧洲型和美洲型PRRSV,说明2C5和2C6具有较好的特异性。用纯化的DV全病毒作为包被抗原,单克隆抗体2C5和2C6与病毒的结合可以被猪欧洲型PRRSV阳性血清阻断。本研究制备的2C5和2C6单克隆抗体为建立特异性检测欧洲型PRRSV抗体方法提供了基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28
【图文】：

16图 2.2 5 株欧洲型 PRRSV 与参考毒株的遗传进化树(A) 基于 ORF7 基因的进化树 (B)基于 ORF5 基因的进化树(C) 基于全基因组序列的进化树 (D)基于 Nsp2 基因的进化树Fig. 2.1 Phylogenetic trees of 5 PRRSV isolates in this study and reference strains of genotype 1(A) The phylogenetic tree based on the complete genome. (B) The phylogenetic tree based on ORF5 gene.(C) The phylogenetic tree based on ORF7 gene. (D) The phylogenetic tree based on Nsp2 gene.注： 5 株欧洲型 PRRSV 分离株以蓝色和 标注，中国大陆提交的其他欧洲型 PRRSV 序列用红色标注，Note: Five EU-type PRRSV isolates were labeled by blue color and , while other reference European PRRSVsequences submitted by mainland China were labeled by red color.

中国农业科学院硕士学位论文 第二章 欧洲型 PRRSV 的流行病学调查株 WK141 存在明显的重组，WG9、ZD1、HN7 株欧洲型 PRRSV 均不存在重组。通过重组分析可以看出： WK14 为重组毒株，BJEU06-1 和 NVDC-FJ 提供来了重组片段，Simplot 显示重组断点位于 951 位和 3251 位碱基；WK141 重组毒株，NVDC-NM1-2011 和 HENZMD-10 为亲本毒株，且重组断点位于：7131 和 9111 位碱基处。

第的筛选疫的小鼠的脾细胞与 SP2/0 细眼观察到明显的细胞团块（如亚克隆，每次克隆的杂交瘤的亚克隆，直至所有亚克隆抗体的杂交瘤细胞系，最终隆抗体的杂交瘤细胞，命名为2C6 能识别欧洲型 PRRSV D 等美洲型 PRRSV（如图 3.4

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本文编号：2756962