猫疱疹病毒HR-1毒株的分离鉴定及其间接ELISA方法的建立

发布时间：2020-07-17 04:19

【摘要】：猫疱疹病毒I型(Feline herpesvirus-1,FHV-1)是猫传染性鼻气管炎的病原体,可引起猫科动物急性、高度接触性上呼吸道疾病。FHV-1属于疱疹病毒科,甲型疱疹病毒亚科成员,为双股DNA病毒。FHV-1隐性感染和感染后康复的猫能长期带毒和排毒,成为传染源。同其他疱疹病毒一样,FHV-1可潜伏在猫的三叉神经节,并在猫免疫力低下时再激活而导致发病,给该病的防控造成困难。因此,加强对国内FHV-1流行毒株的分离鉴定及诊断方法的建立对该病的防控具有重要意义。本研究首先从病猫眼鼻拭子中分离病毒,进行一系列鉴定。结果表明该分离株可在CRFK细胞上产生典型CPE,病毒滴度可达到10~8 TCID_(50)/mL。电镜下观察到圆形、有囊膜、直径大小约150 nm的病毒颗粒。提取病毒基因组,扩增gD基因,得到一条1125 bp大小的特异性条带,经测序分析发现其与标准毒株FHV-1 C-27 gD基因序列相似性达100%,表明该分离株为FHV-1,命名为HR-1。IFA结果显示接种HR-1的CRFK细胞出现特异性荧光。动物回归试验结果显示,HR-1感染家猫后,临床主要表现为眼结膜炎和鼻气管炎;病理切片发现肺脏上皮细胞组织增生,肾小管上皮细胞空泡化、坏死等;利用Real-time qPCR方法,能从感染猫的眼、鼻拭子中检测到病毒核酸,且在感染后第4-6天病毒载量达到最高峰,同时证明HR-1在三叉神经中可以复制。HR-1对家猫的致死率可达100%,表明HR-1对家猫有较强的致病性。其次,选取高度保守且免疫原性好的gD糖蛋白为研究对象,利用TMHMM Server v.2.0和BepiPred 1.0 server在线软件预测gD蛋白的跨膜区及抗原表位富集区,确定了从505 bp-987 bp为gD抗原表位富集区,该片段长483 bp;克隆表达gD抗原表位富集区,制备了重组gD-483蛋白,经SDS-PAGE、Western blot分析,gD-483蛋白具有良好的抗原性且为可溶性表达。将其作为包被抗原,建立FHV-1抗体间接ELISA诊断方法。结果显示gD-483重组蛋白的最佳包被浓度为2ng/μL,时间为37°C 2 h;待检血清最佳稀释度为1:400,作用时间为37°C 45 min;二抗最佳稀释度为1:8000,作用时间为37°C 45 min;底物最佳显色时间为37°C 5 min。确定阴阳性血清的临界值为0.432;与FCV、FPV、FIPV-1、FIPV-2阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;组内、组间变异系数均小于10%,重复性良好;FHV-1的阳性血清稀释至1:3200仍显示为阳性,敏感性好;与IFA比对试验符合率92%。利用建立的间接ELISA方法检测100份猫血清样品,抗体阳性率为77%。本研究分离并鉴定了一株国内FHV-1 HR-1,对其进行致病性分析,可为猫传染性鼻气管炎疫苗的评价提供效力检验用强毒;以gD重组蛋白为包被抗原建立的间接ELISA诊断方法,操作简便,可为FHV-1感染的防控奠定基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

科学院硕士学位论文 第二章 FHV-1分离鉴定及致-1 毒株感染动物后，在感染六天麻醉动物并处死。取材部位为三叉神经节、肺脏气管，同时取对照组动物相同的组织。取材的动物组织除三叉神经节外各样品分液氮速冻后置于-80 °C 保存，待提取组织核酸，进行荧光定量检测，另一份置于固定；对因 HR-1 感染死亡的动物，取材部位为三叉神经节，肺脏、气管、肾脏并做同样处理，最后将固定的组织样品送至哈尔滨兽医研究所病理切片室进行切进行观察分析。果病毒分离纯化及 TCID50测定采集的拭子样品处理后接种 CRFK 单层细胞 3 d 后出现明显的 CPE，可见细胞聚后细胞逐渐脱落（如图 2.1）。将病毒在 CRFK 细胞中通过蚀斑纯化 3 代，将纯胞后测定其滴度为 108TCID50/mL。

（如图 2.1）。将病毒在 CRFK 细胞中通过蚀 108TCID50/mL。A:感染组 CRFK 细胞 B：对照组 CRFK 细图 2.1 拭子接种 CRFK 细胞Fig 2.1 CRFK cell inoculated with swabs培养物上清进行电镜负染观察，病毒粒子外约为 150 nm（见图 2.2）

M：DL2000 DNA Marker；1：gD；2：阴性对照图 2.3 gD 基因的 PCR 扩增结果Fig.2.3 Amplication of gD gene by PCRFK 细胞 48 h 后，以 FHV-1 阳性血清作为一抗，以 结果显示，病毒感染的细胞单层中出现特异性绿色染 HR-1 的 CRFK 细胞; B:阴性对照图 2.4 HR-1 病毒 IFA 鉴定结果B

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本文编号：2758966