IBDV强、弱毒株病毒样颗粒免疫原性的比较及噬菌体抗IBDV抗体文库的构建
发布时间：2020-07-17 05:47
【摘要】：传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性、致死性疾病,主要攻击禽类重要的中枢免疫器官法氏囊,能够引起免疫抑制进而导致严重的继发感染,最终造成鸡的死亡,危害家禽养殖业的发展。疫苗是防控该病的有效方法,传统的疫苗存在一些难以避免的缺点,弱毒苗的广泛使用易导致毒株突变,而强毒灭活苗存在灭活不彻底等生物安全隐患。近年兴起的病毒样颗粒(VLP)等亚单位疫苗能克服上述缺点,诱导机体产生良好的免疫反应。目前很多鸡场也采用卵黄抗体紧急治疗IBD发病鸡群,在一定程度上降低了经济损失。卵黄抗体虽然制备方式简单,但是具有纯度差和抗体滴度低等缺点,采用基因工程方法制备高纯度的治疗性抗体是病毒性疾病治疗的发展趋势。VP2是IBDV唯一的衣壳蛋白,位于病毒衣壳的外部,能够刺激机体产生中和抗体,决定IBDV的抗原性,是制备VLP疫苗的重要靶标。然而IBDV强、弱毒VP2诱导免疫反应存在差异,为筛选更有效的IBDV VLP候选疫苗,本研究在IBDV超强毒株Gx株VLP制备的基础上,扩增IBDV人工致弱毒株Gt株的VP2基因序列,将其克隆在酵母表达载体pAO815上构建成pAO815-NHisGtVP2质粒,将其电转至酵母菌株SMD1168后,经过5天的诱导表达,成功表达了Gt VP2蛋白。通过疏水层析纯化的方法制备了纯度高的弱毒VLP,建立了更高效的VLP制备方法。琼脂扩散试验结果表明制备的Gt VLP具有良好的抗原性。将Gx和Gt VLP免疫SPF鸡,比较评价了二者对IBDV超强毒的免疫保护效果。强、弱毒VLP免疫组血清中和抗体滴度在免疫5周内始终维持在较高的水平,表明二者均能诱导产生持续的免疫反应。强毒VLP免疫组能够产生100%的攻毒保护率,攻毒后法氏囊状态良好。而弱毒VLP免疫组能够产生80%的攻毒保护率,攻毒后鸡的法氏囊萎缩明显。这些结果表明,免疫强毒VLP比免疫弱毒VLP对鸡群抵抗IBDV超强毒株具有更好的保护效果。噬菌体展示技术是筛选抗体的有效技术手段,为了筛选有效的IBD治疗性抗体,本研究从免疫过Gx VLP的鸡全血中分离外周血淋巴细胞,从中扩增出抗体的轻链可变区(VL区)与重链可变区(VH区),通过柔性Linker将二者连接。将其克隆进噬菌粒构建了pCANTAB5E-scFv质粒,转化之后建立了鸡源噬菌体抗IBDV抗体文库。通过三轮的淘选富集以及ELISA鉴定,最终测序得到了5株阳性抗体序列。表达纯化后的单链抗体的中和活性有待进一步验证。本研究比较了强、弱毒病毒样颗粒的免疫保护效果,为临床上亚单位疫苗的研究和应用提供了一定的参考依据,建立了噬菌体抗IBDV抗体文库并筛选到了5株抗体序列,为IBDV高效抗体的筛选与表达奠定了基础,这些研究对IBDV的防控具有重要意义。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言构的构成，更可能的是具有调控功能，可能在病毒的调节和释放过程中起到重要的作用。在所有的血清Ⅰ型 IBDV 菌株中，VP5 碱性较高、保守并富含半胱氨酸。VP5 在诱导法氏囊产生病理现象中起到了重要的作用（Yao et al., 1998）。VP5 在细胞膜内释放降低了细胞的存活能力，VP2 和VP5 已被证实能够诱导体外培养细胞的凋亡（Rodriguez et al., 2005 ;Yao et al., 1998）。
中国农业科学院硕士学位论文 第二章 弱毒株 VP2 病毒样颗粒的表达与制备化后电镜观察图片（图 2-4 B）显示，纯化前杂蛋白较多，且形态不好，纯化后形成形态较好的直径 20 nm 的 VLP 颗粒，表明通过 VP2 通过自组装形成了 VLP 结构。A: SDS-PAGE; B: western blotM：Protein Maker A1-A8: Protein products that are received sequentially.M:蛋白分子量标准; A1-A8:纯化时收集的蛋白样品图 2-3 疏水层析纯化 SDS-PAGE（A）、Western blot(B)Fig.2-3 Hydrophobic Chromatography of SDS-PAGE（A）、Western blot(B)A BM A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8100KD70KD55KD40KD35KDA1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8A B
-5 琼脂扩散（AGP）试验鉴定 GtVP2的病毒样颗粒的抗原性f antigenicity of virus-like particles whic性的疾病，主要侵害鸡的法氏囊衣壳蛋白 VP2 蛋白已经在大肠杆hen et al., 2005;Dey et al., 2009）。表达系统能够表达出空间构象较酵母表达系统对于解决蛋白的不其是对于病毒衣壳蛋白和囊膜蛋操作简单的特点（Valenzuela et等修饰作用。因此，相对于原核白，所以该系统在成功表达并修DV 的衣壳蛋白 VP2，成功获得了细胞等表达体系表达的单体 VP
本文编号：2759056
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言构的构成，更可能的是具有调控功能，可能在病毒的调节和释放过程中起到重要的作用。在所有的血清Ⅰ型 IBDV 菌株中，VP5 碱性较高、保守并富含半胱氨酸。VP5 在诱导法氏囊产生病理现象中起到了重要的作用（Yao et al., 1998）。VP5 在细胞膜内释放降低了细胞的存活能力，VP2 和VP5 已被证实能够诱导体外培养细胞的凋亡（Rodriguez et al., 2005 ;Yao et al., 1998）。
中国农业科学院硕士学位论文 第二章 弱毒株 VP2 病毒样颗粒的表达与制备化后电镜观察图片（图 2-4 B）显示，纯化前杂蛋白较多，且形态不好，纯化后形成形态较好的直径 20 nm 的 VLP 颗粒，表明通过 VP2 通过自组装形成了 VLP 结构。A: SDS-PAGE; B: western blotM：Protein Maker A1-A8: Protein products that are received sequentially.M:蛋白分子量标准; A1-A8:纯化时收集的蛋白样品图 2-3 疏水层析纯化 SDS-PAGE（A）、Western blot(B)Fig.2-3 Hydrophobic Chromatography of SDS-PAGE（A）、Western blot(B)A BM A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8100KD70KD55KD40KD35KDA1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8A B
-5 琼脂扩散（AGP）试验鉴定 GtVP2的病毒样颗粒的抗原性f antigenicity of virus-like particles whic性的疾病，主要侵害鸡的法氏囊衣壳蛋白 VP2 蛋白已经在大肠杆hen et al., 2005;Dey et al., 2009）。表达系统能够表达出空间构象较酵母表达系统对于解决蛋白的不其是对于病毒衣壳蛋白和囊膜蛋操作简单的特点（Valenzuela et等修饰作用。因此，相对于原核白，所以该系统在成功表达并修DV 的衣壳蛋白 VP2，成功获得了细胞等表达体系表达的单体 VP
【参考文献】
相关期刊论文 前5条
1 李少伟;夏宁邵;;大肠杆菌表达的病毒样颗粒疫苗[J];生命的化学;2014年01期
2 祁小乐;王笑梅;高玉龙;高宏雷;;鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究进展[J];中国预防兽医学报;2008年08期
3 董清华;沈元月;;酵母表达系统研究进展与展望[J];北京农学院学报;2008年02期
4 王晓红;卢海蓉;章刚;陈少娟;黄德新;李凌云;林枫;;单纯疱疹病毒II型糖蛋白G主要抗原表位的表达和抗原性检测[J];中国生物工程杂志;2007年09期
5 齐连权,陈薇,来大志,于长明,王海涛;毕赤酵母表达系统研究进展[J];中国生物工程杂志;2002年06期
本文编号：2759056
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2759056.html
