基于O型口蹄疫病毒样颗粒的竞争ELISA方法的建立及应用

发布时间：2020-07-17 05:55

【摘要】：口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是造成畜牧业经济严重损失的传染病之一,FMD的爆发不仅严重降低了畜群的生产力,还影响易感动物及其产品的进出口贸易。目前,已开发多种ELISA方法广泛用于检测畜群口蹄疫病毒抗体。但是,基于不同形式和抗原类型的ELISA方法存在抗原制备困难,病毒扩散风险高、假阳性高、敏感性较低及操作复杂等不同的缺点。本实验室前期研究证实,O型FMD病毒样颗粒(VLPs)类似天然的口蹄疫病毒、能诱导机体免疫性保护、易于制备且不受生物安全设施的限制、安全性高。因此,本研究以O型FMD VLPs作为诊断抗原,建立竞争ELISA方法检测O型口蹄疫病毒抗体,以期为FMD检疫和防控提供技术手段。本研究经原核表达、纯化及组装制备O型FMD VLPs,将所得目的蛋白分别进行SDS-PAGE、DLS、TEM及Western blot试验鉴定,并测定其蛋白浓度;以试验所得O型FMD VLPs为抗原免疫家兔制备高免血清,并通过饱和硫酸铵沉淀法、Protein A亲和层析法及过碘酸钠法,对高免血清中的IgG进行纯化和标记,得到HRP-IgG后进行SDS-PAGE和Western blot试验鉴定及ELISA方法测定其效价;以O型FMD VLPs作为诊断抗原建立竞争ELISA方法,试验通过棋盘交叉滴定法、方阵滴定法及绘制ROC曲线等方法确定了竞争ELISA方法最佳试验条件及判断标准,组装试剂盒并进行交叉反应试验,特异性试验、敏感性试验、符合率试验、批内和批间重复性试验及37℃加速保存试验。试验结果如下:原核表达、纯化及组装成功获得O型FMD VLPs,其粒径大小基本聚集在20 nm~50 nm之间,与天然FMDV颗粒大小相似,其可与O型FMDV阳性血清发生特异性反应,测定其浓度为836.7μg/mL;以O型FMD VLPs为抗原免疫家兔,成功制备高免血清。纯化和标记高免血清中的IgG,成功获得HRP-IgG,测定HRP-IgG抗体滴度大于1:640 000,且HRP-IgG可与O型FMD VLPs特异性结合;竞争ELISA方法的最佳试验条件及判断标准如下:抗原包被浓度为0.5μg/mL,血清稀释度为1:4,酶标抗体稀释度为1:18 000,抗原包被条件为4℃过夜或37℃2.5 h,封闭液为1%BSA,封闭液作用条件为37℃30 min,血清和酶标抗体作用条件为37℃30 min,底物作用条件为37℃10 min,临界值设定为PI=50%,即PI50%判为阴性血清,当PI"g50%判为阳性血清。通过不同试验证实该检测方法无交叉反应,敏感性为96%,特异性为100%,批内和批间重复试验变异系数均小于15%,与LPB-ELISA试剂盒、VDpro~?ELISA试剂盒及PrioCHEK~?ELISA试剂盒的符合率分别是97%、99%及97%;37℃加速保存试验显示试剂盒能在37℃条件下保存至少7天。本研究成功建立用于O型口蹄疫病毒抗体检测的竞争ELISA方法并组装试剂盒,并证实该检测方法具有敏感、特异、简单及稳定等优点,可为FMD防控提供更好的检测技术,并具有良好的应用前景。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

杂蛋白,鉴定结果,显色,血清

TMB，每孔 50 μL，37℃显色 15 min。液，每孔 50 μL 混匀，酶标仪上读取样品 OD450 nm 测定 OD450 nm/阴性血清 OD450 nm），测定 HRP-IgPs 表达及纯化鉴定结果验结果化及组装后得到目的蛋白进行SDS-PAGE试验鉴定及组装后得到目的蛋白条带大小与 O 型 FMD VL组装成功获得 O 型 FMD VLPs（由 VP0、VP1、白纯度较高，杂蛋白较少，符合本试验要求。

纳米粒,粒径大小,口蹄疫病毒,动态光散射

第二章 O 型口蹄疫病毒样颗粒原核表达、纯化及高免血清的制备.2 动态光散射试验（DLS）结果将上述体外组装后所得目的蛋白进行 DLS 试验，试验结果见图 2-2。试验结果装的目的蛋白粒径大小基本聚集在 20 nm~50 nm 之间，颗粒具有良好的均一性范围内的蛋白量占总蛋白量的 97.2%。说明 O 型 FMDV 的 3 种结构蛋白在体外功组装成 O 型 FMD VLPs。

粒径大小,形状,纳米粒,结构蛋白

图 2-2 纳米粒度仪测定 O 型 FMD VLPs 粒径大小Fig 2-2 Size of O-type FMD VLPs measured by DLS试验（TEM）结果组装后所得目的蛋白进行 TEM 试验，试验结果见图 2-3。蛋白粒径大小同样聚集在 20 nm~50 nm 之间，颗粒呈圆形。TEM 进一步证实 O 型 FMDV 的 3 种结构蛋白在体外组LPs。

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