Myostatin基因对骨骼肌代谢机制影响的定量蛋白组学与磷酸化蛋白组学研究
发布时间：2020-07-17 06:19
【摘要】：骨骼肌是机体能量调节的关键部位,肌肉生长抑制素Myostatin(MSTN)作为一种重要的肌肉生长发育负调控因子,在骨骼肌的生长发育过程中起着非常关键的作用。大量的研究表明,抑制MSTN基因的表达,不仅仅能够在生产方面提高畜禽的瘦肉产量,而且可以用于医学方面肌肉萎缩相关疾病的研究。目前对于MSTN功能的研究主要依赖于MSTN~(-/-)小鼠模型,本研究利用之前构建的MSTN~(-/-)牛模型,采用高通量的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术,对MSTN在肌肉生长发育过程中的调控机制进行了深入研究。1.本研究利用TMT-6 plex标记的蛋白质组学技术,对MSTN~(-/-)内蒙古黑牛和野生型牛的腿臀肌组织中蛋白的表达丰度变化进行了对比研究。本次质谱结果共鉴定到1,678个有定量的蛋白,其中发现72个蛋白为差异表达的蛋白(Fold change=1.55;P≤0.05)。通过对这72个差异蛋白的功能分析,我们发现MSTN~(-/-)组中与肌肉发育相关的蛋白显著上调,同时,参与脂代谢、线粒体代谢及呼吸链的活性相关生物学过程的蛋白也都呈上调表达的趋势。生物信息学的分析结果也表明,72个差异蛋白主要参与脂肪酸代谢、氧化磷酸化过程、PPAR信号通路、肌肉的生长发育等代谢调控通路。2.在蛋白组学鉴定的同时,我们利用TiO_2技术对肽段进行富集,对MSTN~(-/-)牛和野生型牛进行了肌肉的磷酸化蛋白组学研究。最终鉴定到1,777个磷酸化肽段,这些肽段归属于433个磷酸化蛋白;同样,在Fold change=1.55,P≤0.05的筛选条件下,我们获得50个差异表达的磷酸化肽段,这些肽段归属于36个蛋白。对这36个差异磷酸化蛋白进行生物信息学分析,结果显示差异磷酸化蛋白主要参与肌肉的生长发育和糖酵解等生物过程。3.综合蛋白组学和磷酸化组学的研究结果,我们发现在MSTN~(-/-)牛的肌肉组织中,上调的差异蛋白主要富集在糖酵解途径和脂肪酸降解途径中,结合肌肉中糖原含量和肌间脂肪含量的测定结果,发现MSTN基因敲除后,不仅能够通过增强糖酵解途径加强糖原的分解,而且能够通过增强线粒体的活性促进脂肪酸的β氧化进而降低肌间脂肪含量,这两个途径同时为肌肉的生长发育提供更多的能量。同时我们还发现,MSTN~(-/-)是通过提高AMP/ATP的比值激活AMPK信号通路发挥对糖代谢和脂代谢的调控功能,进而调控肌肉的生长发育和正常的生理活动。本研究通过对MSTN~(-/-)牛与野生牛的肌肉组织进行比较蛋白组学和磷酸化蛋白组学分析,研究MSTN影响肌肉生长发育的调控机制。一方面我们发现了一系列与MSTN功能相关的调节蛋白;另一方面我们发现MSTN可以激活AMPK信号通路,同时调节糖代谢和脂代谢这两大代谢通路。本研究结果不仅为研究MSTN对肌肉生长发育的调控机制提供了理论基础,同时对医学上关于糖尿病和肥胖病的研究提供了新的靶点。
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.2
【图文】：
图 2-1 蛋白组学试验设计图Figure 2-1 Experimental design and schematic diagram of the proteomics workflRT-PCR 检测肌肉组织中的总 RNA，将其反转录为 cDNA，检测部分基因在 mR平上的表达量差异。按照 Trizol 的试剂说明书进行总 RNA 的提op ND 2000c 检测提取的总 RNA 的浓度，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检总 RNA 的主要步骤为：从超低温冷冻冰箱中取出适量的肌肉组织液氮将组织研磨成粉末状。将粉状物置于加有 1mL Trizol 裂解液的中，并摇匀。再加入0.2mL氯仿，摇匀震荡后在4℃离心机中离心15m吸取上清至新管中，再加入 2 倍上清体积的异丙醇，混匀，继续 4℃离0 r/min）。这次要弃掉上清，留下沉淀物，用 1mL DEPC 水配制的 7，再次 4℃离心 5min（7,500 r/min）。弃上清，用 20μL 的 DEPC 水
天津农学院硕士学位论文图 2-3 所示，全蛋白分布均匀，可供后续分析使用。图2-3 考马斯亮蓝染色法定性肌肉蛋白提取结果：T1, T2, T3分别代表3头转基因组牛；C1, C2,C3 分别为 3 头非转基因牛；M 代表 marker。Figure 2-3 Coomassie brilliant blue staining method for qualitative muscle protein extraction. T1,T2, T3 represent the three transgenic cattle, C1, C2, C3 represent the three wild-typecattle and the M represent the marker.2.2.2 蛋白组学鉴定结果统计分析利用蛋白组学技术，本研究在内蒙古黑牛的腿臀肌组织中共鉴定到 1,666 个有定量的蛋白，每种蛋白至少包含一条独特的肽段。以 MSTN-/-组比对照组的变化倍数作为筛选差异蛋白的标准，通过 Persurs 软件进行 t 检验和差异倍数的筛选。首先，对 9 列数据进行单样本 t 检验，通过 t 检验的蛋白个数有 588 个，即 MSTN-/-组与对照组相比，肌肉组织中有 588 个蛋白的表达是有差异的。然后设置差异倍数
图 2-4 蛋白组学结果统计Figure 2-4 The result of proteomic analysis生物信息学分析结果蛋白的功能分析，可将 72 个差异蛋白分为 4 大类（图 2相关的蛋白约占总数的 22%，与转录翻译相关蛋白占 17占 14%，与脂代谢相关的蛋白占 11%，其余的蛋白功能（见附表 1）。通过观察发现，上调的 54 个蛋白几乎都分蛋白多属于杂蛋白，彼此之间的关联性不强。据此，我们古黑牛肌肉组织的脂代谢和线粒体活性的调节。
本文编号：2759089
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.2
【图文】：
图 2-1 蛋白组学试验设计图Figure 2-1 Experimental design and schematic diagram of the proteomics workflRT-PCR 检测肌肉组织中的总 RNA，将其反转录为 cDNA，检测部分基因在 mR平上的表达量差异。按照 Trizol 的试剂说明书进行总 RNA 的提op ND 2000c 检测提取的总 RNA 的浓度，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检总 RNA 的主要步骤为：从超低温冷冻冰箱中取出适量的肌肉组织液氮将组织研磨成粉末状。将粉状物置于加有 1mL Trizol 裂解液的中，并摇匀。再加入0.2mL氯仿，摇匀震荡后在4℃离心机中离心15m吸取上清至新管中，再加入 2 倍上清体积的异丙醇，混匀，继续 4℃离0 r/min）。这次要弃掉上清，留下沉淀物，用 1mL DEPC 水配制的 7，再次 4℃离心 5min（7,500 r/min）。弃上清，用 20μL 的 DEPC 水
天津农学院硕士学位论文图 2-3 所示，全蛋白分布均匀，可供后续分析使用。图2-3 考马斯亮蓝染色法定性肌肉蛋白提取结果：T1, T2, T3分别代表3头转基因组牛；C1, C2,C3 分别为 3 头非转基因牛；M 代表 marker。Figure 2-3 Coomassie brilliant blue staining method for qualitative muscle protein extraction. T1,T2, T3 represent the three transgenic cattle, C1, C2, C3 represent the three wild-typecattle and the M represent the marker.2.2.2 蛋白组学鉴定结果统计分析利用蛋白组学技术，本研究在内蒙古黑牛的腿臀肌组织中共鉴定到 1,666 个有定量的蛋白，每种蛋白至少包含一条独特的肽段。以 MSTN-/-组比对照组的变化倍数作为筛选差异蛋白的标准，通过 Persurs 软件进行 t 检验和差异倍数的筛选。首先，对 9 列数据进行单样本 t 检验，通过 t 检验的蛋白个数有 588 个，即 MSTN-/-组与对照组相比，肌肉组织中有 588 个蛋白的表达是有差异的。然后设置差异倍数
图 2-4 蛋白组学结果统计Figure 2-4 The result of proteomic analysis生物信息学分析结果蛋白的功能分析，可将 72 个差异蛋白分为 4 大类（图 2相关的蛋白约占总数的 22%，与转录翻译相关蛋白占 17占 14%，与脂代谢相关的蛋白占 11%，其余的蛋白功能（见附表 1）。通过观察发现，上调的 54 个蛋白几乎都分蛋白多属于杂蛋白，彼此之间的关联性不强。据此，我们古黑牛肌肉组织的脂代谢和线粒体活性的调节。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 姜卫红,PattersonJohnA;乙酸菌糖磷酸化作用的研究[J];微生物学报;1999年06期
本文编号：2759089
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