鼠李糖乳杆菌对早期断奶仔猪肠道内T淋巴细胞数量及分化的影响

发布时间：2020-07-17 06:29

【摘要】：益生菌被联合国(FAO)和世界卫生组织(WHO)定义为活的微生物,当使用合适的数量时,将对人和动物机体产生有益作用。益生菌可用于包括预防和治疗肠道感染,泌尿生殖系统疾病,细菌性阴道病和皮肤病等。而益生菌是如何提高机体免疫力是目前研究的热点之一。目前最常用的益生菌菌株是乳杆菌属,鼠李糖乳杆菌(LGG)是一种模式益生菌,它可以定植在机体肠道内,对预防和治疗人和动物的多种肠道炎症起关键作用。随着我国畜牧业的不断发展与进步,仔猪的断奶日龄也在逐渐的提前。初生仔猪免疫力低下,肠道菌群紊乱都是引发仔猪腹泻的原因。T细胞是机体免疫功能的重要标志,所以,本试验探究了LGG对仔猪T淋巴细胞的影响,旨在为研发基于乳酸菌的动物微生态制剂奠定了理论基础同时为预防仔猪腹泻开辟了新的思路与途径。具体的研究内容及结果如下:(1)本研究选用LGG ATCC53103为实验菌株。随机选取20日龄健康仔猪6头分为2组,分别为实验组(LGG组)和对照组(生理盐水组),LGG组仔猪每天灌服1mL LGG(6×10~9 CFU/mL)。生理盐水组仔猪每天灌服1mL生理盐水。15d时宰杀仔猪,分别取仔猪的肠系膜淋巴结(MLN),回肠和派氏淋巴结(PPs),回肠和空肠固有层(LP)。通过流式细胞术以及免疫荧光方法检测CD3~+CD4~+T淋巴细胞以及CD4~+CD8~+双阳性T淋巴细胞的表达情况,将MLN中CD3~+CD4~+T淋巴细胞分选并提取RNA,通过荧光定量PCR方法检测CD3~+CD4~+T淋巴细胞转录因子表达情况。结果表明,MTS淋巴细胞增殖结果显示LGG组淋巴细胞增殖情况显著高于生理盐水组(P0.001)。流式细胞术结果显示LGG组仔猪MLN中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞与生理盐水组相比无显著差异(P0.05)。LGG组仔猪空肠,回肠PP中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞与生理盐水组相比有显著差异(P0.05,P0.05)。LGG组仔猪空肠LP中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞与生理盐水组相比有显著差异(P0.05)。LGG组仔猪回肠LP中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞与生理盐水组相比有显著差异(P0.01)。LGG组IEL中CD4~+CD8~+T淋巴细胞显著高于生理盐水组(P0.001)。免疫荧光结果显示LGG组仔猪回肠中CD3~+CD4~+T淋巴细胞多于生理盐水组,PPs中CD3~+CD4~+T淋巴细胞多于生理盐水组。此外,我们通过流式细胞术分选了仔猪MLN中CD3~+CD4~+T淋巴细胞,通过荧光定量PCR方法检测转录因子表达量,结果显示LGG组转录因子T-bet显著高于GATA(P0.01)。LGG组Foxp3~+与ROR差异不显著(P0.05),所以T细胞趋向Th1分化。综上所述LGG可以刺激仔猪T淋巴细胞数量增加,并且趋向Th1分化。(2)本研究选用LGG ATCC53103为实验菌株。随机选取健康仔猪12头随机分为2组,分别为实验组(LGG组)和对照组(生理盐水组),LGG组仔猪每天灌服1mL LGG(6×10~9 CFU/mL)。生理盐水组仔猪每天灌服1mL生理盐水。分别在30d和45d时宰杀仔猪,取仔猪的MLN,空肠及回肠PPs,LP。通过流式细胞术方法检测CD3~+CD4~+T淋巴细胞表达情况,并通过肠道石蜡切片观察肠道绒毛发育情况。结果表明:30d,45d时流式细胞术结果显示LGG组仔猪MLN中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞与生理盐水组相比差异显著(P0.05,P0.01)。LGG组仔猪空肠PP中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞与生理盐水组相比有显著差异(P0.05)。LGG组仔猪回肠PP中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞与生理盐水组(相比有显著差异(P0.05,P0.01)。LGG组仔猪LP中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞与生理盐水组相比有显著差异(P0.001,P0.05)。LGG组仔猪回肠绒毛长度与生理盐水组相比差异显著(P0.01,P0.001)。HE染色结果显示LGG组(30d、45d)仔猪回肠绒毛长度与生理盐水组(30d、45d)相比差异显著(P0.01,P0.01)。LGG组(15d、30d、45d)MLN、空肠PP、回肠PP、LP中CD3~+CD4~+T淋巴细胞均无显著差异(P0.05)。综上所述LGG在30d,45d时同样可以调节早期断奶仔猪肠道内T淋巴细胞增殖,增加CD3~+CD4~+T淋巴细胞数量且具有保护肠道绒毛发育及完整性的作用。(3)为了分析LGG分泌蛋白P40的免疫学作用,我们将P40蛋白基因合成,将基因连接到pET28a载体,通过镍柱纯化出P40蛋白。随机选取一头仔猪,分离LP淋巴细胞。分别用LGG,P40,T细胞活化抑制剂(CSA)刺激细胞,通过流式细胞术方法检测CD3~+CD4~+T淋巴细胞表达情况。流式细胞术结果显示CSA能有效抑制T淋巴细胞活化。12h,24h,36h LGG组和P40组诱导仔猪淋巴细胞的CD3~+CD4~+T淋巴细胞显著高于对照组(P0.001)。在12h,24h,36h LGG+CSA组和P40+CSA组也显著高于CSA组(P0.05)。LGG与P40组无明显差异(P0.05)。由此得知,LGG蛋白P40在调节仔猪T淋巴细胞变化中起主要作用。LGG对仔猪T淋巴细胞起到调节作用使T淋巴细胞趋向Th1分化,同时LGG对仔猪T淋巴细胞调节具有保护肠道绒毛发育及完整性的作用,并且LGG分泌的P40蛋白在此过程中起到了关键性的作用。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828.5
【图文】：

图 1-1 灌服 LGG 对仔猪的淋巴细胞增殖情况（Fig 1.1 Lymphocyte proliferation in LGG at 15仔猪 T 淋巴细胞数量影响的结果 对仔猪 MLN 中 CD3+CD4+T 淋巴细胞数量影响的

图 1-2 灌服 LGG 的仔猪 MLN 中 CD3+CD4+T 淋巴细胞数量（15d）Fig 1-2 The number of CD4+CD8+T lymphocytes in MLN of piglets with LGG at 15d1.3.2.2 LGG 对仔猪空肠 PPs 中 CD3+CD4+T 淋巴细胞数量影响的结果将仔猪空肠 PPs 单细胞悬液进行抗体染色，通过流式细胞术方法检测仔猪空肠 PPs 中 CD3+CD4+T 淋巴细胞数量的变化，从图 1-3 中可知，灌服 LGG 的仔猪

图 1-3 灌服 LGG 的仔猪空肠 PPs 中 CD3+CD4+T 淋巴细胞数量（15d）Fig 1-3 The number of CD3+CD4+T lymphocytes in jejunum PPs of piglets with LGG at 15d1.3.2.3 LGG 对仔猪回肠 PPs 中 CD3+CD4+T 淋巴细胞数量影响的结果将仔猪回肠 PPs 单细胞悬液进行抗体染色，通过流式细胞术方法检测仔猪回

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本文编号：2759100