阴道毛滴虫端粒DNA鉴定及其调节蛋白研究

发布时间：2020-07-17 10:38

【摘要】：阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,TV)是寄生在人体泌尿生殖系统的寄生性原虫。它不仅能够引起女性滴虫性阴道炎和宫颈炎、男性尿道炎和前列腺炎,还可以感染小鼠和松鼠猴。呈世界性分布,是一种危害人兽健康的重要人兽共患寄生性原虫。目前,尚无有效的防治方法,究其原因是由于对阴道毛滴虫的细胞分子生物学特性的研究较少。而端粒是存在于真核细胞染色体末端的DNA重复序列与一些相关蛋白组成的特殊结构,由端粒酶进行调控。端粒及其相关蛋白的发现成为分子生命科学研究的热点之一。在大多数真核生物中,包括原虫,如贾第虫,微小隐孢子虫、利什曼原虫及布氏锥虫等端粒DNA重复序列及端粒相关蛋白均有研究。但是作为真核生物分支早期的阴道毛滴虫,其端粒DNA重复序列的研究未见报道,通过生物信息学分析在阴道毛滴虫基因组中并没有端粒酶序列。那么是什么对阴道毛滴虫端粒DNA的延伸进行调节。为此,本试验将对阴道毛滴虫端粒DNA及其调节蛋白进行研究。具体如下:端粒DNA重复序列鉴定:利用S1核酸酶及Mbo I限制性内切酶对阴道毛滴虫基因组DNA切割并与pUC18载体相连后测序得出重复序列(TTTTAGGG)_n,长度约在2000 bp。通过BAL31核酸酶消化和FISH证明了该重复序列能够定位于阴道毛滴虫染色体末端,是阴道毛滴虫的端粒DNA重复序列。端粒DNA与端粒结合蛋白TRF和TBP相互作用研究:应用原核表达技术构建端粒结合蛋白pET-TRF和pET-TBP原核表达载体,以Western blot及IIF和FISH联合试验对TRF和TBP在阴道毛滴虫体内表达定位,EMSA研究TRF和TBP在体外与端粒DNA结合作用。Western blot结果显示TRF和TBP均在细胞核中表达,是一种低表达的核蛋白。IIF和FISH联合试验证明了TRF和TBP都能够与端粒DNA呈点状部分共定位于阴道毛滴虫细胞核染色体末端。EMSA中阻滞条带表明了两者均能够在体外与双链端粒DNA结合。端粒结合蛋白TRF和TBP对端粒DNA的影响:分别构建针对TRF和TBP的锤头状核酶TRF-HR和TBP-HR研究端粒结合蛋白TRF和TBP分别在体内对端粒DNA延伸的影响。体外切割试验得出TRF-HR和TBP-HR能够有效的对TRF和TBP的体外转录体进行切割,其效率分别为89.4%和92.1%。经电穿孔转染后荧光定量PCR检测出TRF-HR和TBP-HR同样能够在体内对TRF和TBP进行切割,切割效率分别为82.6%及85.2%。Western blot分析显示TRF和TBP在蛋白质水平上也明显减少。通过Southern blot检验得出,在TRF和TBP减少时,端粒DNA重复序列长度反而增加,即阴道毛滴虫TRF和TBP对端粒DNA延伸起到负调节作用。SPP对端粒DNA的影响:应用原核表达技术构建SPP原核表达载体pET-SPP,经EMSA研究SPP在体外与端粒DNA结合作用。构建锤头状核酶SPP-HR研究SPP在体内对端粒DNA延伸的影响。EMSA中阻滞条带表明了SPP能够在体外与双链端粒DNA结合。锤头状核酶SPP-HR体外切割试验得出SPP-HR对SPP的体外转录体的切割效率为89.5%。电穿孔转染至阴道毛滴虫体内,荧光定量PCR分析表明SPP-HR仍能在体内对SPP进行切割,切割效率为84.6%。Western blot检测得到SPP在蛋白质表达水平上也明显减少。经Southern blot检验得出,在SPP mRNA和蛋白质表达水平降低时,端粒DNA重复序列长度也随之缩短,表明SPP对端粒DNA延伸起到正调节作用。PIKK与SPP相互作用及PIKK对端粒DNA的影响:构建pGEX-PIKK原核表达载体及含有阴道毛滴虫α-SCSB启动子的BiFC载体,采用GST-Pull down和BiFC试验研究PIKK和SPP两者之间的相互作用。构建锤头状核酶PIKK-HR研究PIKK在体内对端粒DNA延伸的影响。GST-pull down结果中能够看到重组PIKK和SPP蛋白相互结合条带。BiFC试验更加直观的检测到红色荧光,从而确定了PIKK和SPP在阴道毛滴虫体内外均存在相互作用。锤头状核酶PIKK-HR体外切割试验得出PIKK-HR对PIKK的体外转录体的切割效率为91.2%。电穿孔转染至阴道毛滴虫体内,荧光定量PCR分析表明PIKK-HR能在体内对PIKK进行切割,切割效率为86.7%。Western blot检测得到PIKK在蛋白质表达水平上也明显减少。经Southern blot检验得出,在PIKK蛋白质表达水平降低时,端粒DNA重复序列长度也随之缩短,说明PIKK对端粒DNA延伸起到正调节作用。综上试验研究表明,在不存在端粒酶的情况下,阴道毛滴虫端粒DNA重复序列(TTTTAGGG)_n的延伸受到端粒结合蛋白TRF和TBP的负调节,以及SPP和PIKK的正调节。为进一步研究阴道毛滴虫端粒调控机制、阴道毛滴虫分子生物学特性及阴道毛滴虫永生化等方面提供了新的思路。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.72
【图文】：

交：将已变性的探针滴加于标本盖玻片上涤：将标本盖玻片加入已预热的 50 %甲酰预热的 1×SSC 中洗涤 3 次，每次 5 min。核：DAPI 对细胞核染色 5 min，用 PBST片及镜检：滴加封片剂后，置于载玻片上滴虫基因组 DNA 提取培养，收集阴道毛滴虫提取总 DNA，进道毛滴虫基因组 DNA 条带清晰，可进行1 2

BAL31 核酸酶消化鉴定以(TTTTAGGG)5设计为地高辛标记探针，将阴道毛滴虫基因组 DNA 间(0、20、40、60、80 min)BAL31 核酸酶及 Mbo I 消化后，与探针杂uthern blot，如图 1-3 显示，随着时间的增加，端粒 DNA 序列逐渐降低图 1-2 阴道毛滴虫(TTTTAGGG)n重复序列Fig 1-2 The highly repetitive sequence (TTTTAGGG)nof T.vaginalis.

Southernblot分析

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本文编号：2759317