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猪Viperin基因的抗炎和抗病毒作用初探

发布时间:2020-07-18 13:07
【摘要】:干扰素刺激因子Viperin定位在细胞内质网和脂滴中,正常表达水平较低,在多种细胞中可被干扰素、脂多糖、poly(I:C)和多种病毒等诱导表达,可以在机体抵抗病原过程中发挥重要作用。目前Viperin基因的抗炎和抗病毒作用主要集中在人类疾病的研究,有关猪Viperin基因的作用研究较少。本研究将构建的猪Viperin基因真核表达载体PB-Viperin转染PK15细胞,分别利用荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blot方法,筛选建立Viperin基因过表达PK15细胞系;为了探讨猪Viperin的抗炎作用,以LPS处理PK15细胞为炎性反应细胞模型,采用RT-PCR和Western blot方法检测TLR4/NF-κB、JAK/STAT信号通路关键基因mRNA和蛋白水平的表达,评价过表达猪Viperin基因在细胞水平的抗炎作用;进一步对猪Viperin基因的抗病毒作用进行了初步研究,以CSFV感染Viperin过表达的PK15细胞为研究对象,从病毒滴度检测、免疫荧光观察法和Western blot蛋白水平检测评价猪Viperin基因对CSFV复制的影响,利用RT-PCR和Western blot方法检测IRF3和STAT1表达,初步揭示猪Viperin基因抗CSFV的分子机制。结果如下:猪Viperin基因过表达细胞系构建:荧光显微镜观察结果显示,PB-Viperin和PB空载转染PK15细胞均发出绿色荧光,说明载体成功转染PK15细胞;RT-PCR和Western blot结果显示,与PB空载转染组相比,PB-Viperin转染组细胞中Viperin mRNA和蛋白表达显著性升高,表明猪Viperin基因在PK15细胞中实现了过表达,经嘌呤霉素筛选获得了稳定过表达Viperin基因的PK15细胞系。猪Viperin基因的抗炎作用:LPS提高了TLR4、JAK/STAT通路关键基因表达水平,即LPS激活了TLR4和JAK/STAT信号通路。RT-PCR结果显示:PK-PBV细胞相较于PK-PB细胞的IL-6mRNA表达下降,Viperin mRNA表达上调,且差异显著。对照组中MyD88、TBK1、NF-κB、IRF3和IFNɑ等基因mRNA表达在PK-PB和PK-PBV中无明显差异;LPS处理后,过表达Viperin能不同程度地下调TLR4信号通路关键因子MyD88、TBK1、NF-κB、IRF3和IFNɑ等基因mRNA的表达,且TBK1、NF-κB和IFNɑ的mRNA表达下降差异显著。提示Viperin可能通过TLR4信号通路抑制细胞炎性反应。LPS能提高PK-PB和PK-PBV中的STAT1 mRNA和蛋白表达水平,与PK-PB相比,LPS组PK-PBV中的STAT1 mRNA和蛋白表达水平降低,Viperin mRNA和蛋白表达水平也发生了下调。提示过表达Viperin能降低LPS升高的STAT1 mRNA和蛋白表达水平。AG490抑制JAK-STAT通路后,STAT1蛋白表达水平显著下降,而Viperin蛋白表达水平显著上升。与LPS组相比,L+A组的STAT1 mRNA和蛋白表达水平降低,而Viperin mRNA和蛋白表达水平升高;与PK-PB细胞相比,PK-PBV中STAT1 mRNA和蛋白表达水平显著降低;Viperin mRNA和蛋白表达水平显著升高。提示Viperin可能通过调节TLR4/JAK/STAT通路发挥抗炎作用。猪Viperin基因的抗病毒作用:与PK-PB细胞相比,CSFV感染后病毒滴度明显下降,下降幅度与CSFV的处理时间及感染复数有关。CSFV感染后E2蛋白表达显著升高,与PK-PB细胞相比,CSFV感染后PK-PBV细胞中E2蛋白明显减少。提示Viperin过表达能抑制CSFV E2蛋白表达,说明Viperin能抑制CSFV复制。CSFV感染后PK-PBV细胞中IRF3和STAT1的mRNA表达上调,阻断STAT信号后,PK-PBV细胞中IRF3和STAT1 mRNA表达上调。提示猪Viperin抑制CSFV复制可能通过JAK/STAT通路调控IRF3的表达进行。
【学位授予单位】:河南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.4
【图文】:

结构示意图,氨基酸残基


N 末端结构是由第 1-42 位氨基酸残基构成,且氨基酸序列在各个物种中表现较大的差异性。N 端蛋白区域包含两亲性的 α 螺旋结构,位于基因的第 7-42 位氨基酸残基,可以构成亮氨酸拉链,不具有形成二聚体等拉链功能,可以结合到膜表面并诱导其扭曲[15]。保守的中间区域位于 Viperi蛋白的 77-209 氨基酸残基,包含 M1-M4 共 4 个相对保守的基本序列,其基因序列和 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)激酶家族的 MoA/PQQ111 具有较高同源性。其中 M1 含有保守的 C3xC2xC 序列,能够与催化硫铁簇结合,降低 SAM 向 5’脱氧腺苷转换,属于 SAM 酶超家族,故 Viperin 又称为 RSAD2(Radical SAM domain containing 2)[16]。由 218-361 氨基酸残基构成的 C 端部分突出到细胞质中,在不同的物种中,其氨基酸序列表现为高保守性,可能参与蛋白与蛋白互作或者介导酶活性的底物识别,发挥重要的抗病毒功能[17]。

模式图,表达调控,模式图,干扰素


促进下游转录因子干扰素调节因子(Interferon regulatory factorIRF3 和 IRF7 进而诱导合成 IFNβ,IFNβ 与细胞表面 I 型 IFNR 结合调导及转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription 1形成异源二聚体,与 IRF9 形成干扰素刺激基因因子 3(Interferon-st合物,ISGF3 复合物发生核移位,结合干扰素刺激应答元件(IFN-stim及 ISG 启动子,诱导 Viperin 基因的表达[21, 22]。依赖性通路中,巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)[23]、VSV[24]ephalitis virus,JEV)[25]等病毒通过结合细胞内过氧化物酶体上的线ndrial antiviral signaling protein,MAVS),激活 IRF1 或 IRF3,直接诱作用,如 VSV 直接通过转录因子 IRF1 刺激 Viperin 基因表达上调,Jctivating protein-1,AP-1)上调 Viperin 基因表达[25]。HCMV 囊膜糖]。VSV 由 MAVS 激活 IRFs 诱导 Viperin 表达[27]。总之,干扰素依rin 基因的表达,干扰素非依赖性通路通过 IRFl 和 IRF3 调节 Viperin

细胞转染,荧光显微镜观察,转染


图 3 荧光显微镜观察细胞转染结果(200×)A:对照;B:转染 PB 空载;C:转染 PB-Viperin。Fig.3 Fluorescence microscope observate cell transfection result(200×)A: no transfection; B: PB Vector transfection; C: PB-Viperin transfection .猪 Viperin 基因在 PK15 细胞中表达结果见图 4。由图 4 可知,与PB 空载转染组相比,PB-Vipe染细胞中的 Viperin 基因 mRNA 表达量明显升高,且差异性极显著(P < 0.001)。Western b果显示,与 PB 空载转染细胞相比,PB-Viperin 转染细胞中的 Viperin 蛋白表达量明显升高,异性显著(P < 0.0001)。提示猪 Viperin 基因在 PK15 细胞中实现了过表达。将 PB-Viperin B 空载转染的细胞经嘌呤霉素筛选,获得稳定转染的细胞系,分别命名为 PK15-PB-VipePK-PBV)细胞和 PK15-PB(PK-PB)细胞。

【参考文献】

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本文编号:2760926

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