狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株构建及特性研究

发布时间：2020-07-18 22:43

【摘要】：狂犬病,一种古老而流行广泛的神经疾病,它影响到差不多所有种类的哺乳动物,包括人类。引起这种疾病的原因是狂犬病病毒(rabies virus,RABV),它是弹状病毒科,狂犬病病毒属的成员。RABV的基因组长度11927nt,包含5个单顺反子RNAs,分别编码:核蛋白、磷酸化蛋白、基质蛋白、糖蛋白和大蛋白。在这些单顺反子之间是4个长度不相同的基因间隔区,间隔区分别含有2、5、5、423个核苷酸。单股负链的RABV基因组结构相对简单,因此对其基因组的操作会更方便。但是相比于同为弹状病毒科的水泡型口炎病毒,RABV的基因间隔区的碱基序列具有不平衡的特点。RABV基因间隔区的不均衡对病毒到底是怎样的影响,是值得我们思考和研究的问题。本课题运用RABV的反向遗传的操作系统对RABV的CVS-11株的基因间隔区进行遗传改造,构建狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株,并进一步探究该毒株间隔区的缩短对CVS-11株各方面特性的影响。通过对本实验保存的狂犬病病毒弱毒株CVS-11株进行序列测定,对其基因间隔区的碱基进行遗传改造,使得各蛋白间的基因间隔区核苷酸是CT,分4段对其全长进行扩增,然后利用In-fusion技术进行同源重组进而完成重组病毒全长基因组的真核表达载体的构建,用两对特异性的引物经过菌液PCR的扩增鉴定,分别得到1570 bp和850 bp的目的条带,证明同源重组成功。然后将N、P、L及G蛋白4个辅助表达质粒与构建的狂犬病病毒CVS-11间隔区缩短的缺失株的全长质粒共转染BSR-T7细胞系,进行重组病毒拯救,直接免疫荧光检测鉴定,最后于荧光显微镜下我们看到了特异性的荧光,证明狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株得到成功拯救并且能够在BSR-T7细胞系中表达。通过对重组病毒的G、L蛋白的基因之间的间隔区进行RT-PCR得到820bp大小的目的条带,证实狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株在细胞中得到稳定地转录。取重组病毒和原毒株CVS-11的细胞培养物,于透射电镜下均可观察到RABV粒子的典型特征。通过绘制重组病毒和原毒株在不同的病毒感染数时证明,重组病毒的病毒表现出与原毒株相似的复制特点,但重组病毒的滴度低于原毒株。将重组病毒和原毒株分别以1×10~7TCID_(50)/mL和1×10~6TCID_(50)/mL的量对小鼠进行外周的肌肉攻毒,10只/组,病毒感染6天后,记录发病和死亡情况。结果显示狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株对小鼠的致死力较强,存活率较低,差异较显著。将1×10~(7。5)TCID_(50)/mL的重组病毒和原毒株灭活后加铝佐剂免疫小鼠,10只/组,14天后,眼球采血,分离血清,采用荧光抗体中和试验检测抗体,结果显示狂犬病病毒CVS-11间隔区的缩短对其有影响,但是差异性并不显著。本课题成功构建了狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株并对其生物学特性、免疫原性进行了研究,结果证实了狂犬病病毒CVS-11株间隔区的缩短对原毒株在细胞上的复制以及免疫原性方面没有显著的影响,但是能够增强小鼠的致病力,影响较明显。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

序列,狂犬病病毒,结构示意图,不均衡性

是 mRNA 的起始部位，最终形成 mRNA 5'端的帽子结构，基有一段保守的 U7 序列，转录后形成 mRNA3'端的 polyA。隔区BV 不同基因之间，其基因间隔区的长度都不相同，在病毒的 N、 P、L 各蛋白基因之间，分别有 2、5、5、 423 nt 的间隔区，而同病毒科中口炎病毒的基因间隔区均为 2nt，为 GA 或 CA，因此 RABV 的基因间不均衡性特征。狂犬病病毒基因间隔区的不均衡性对病毒本身产生怎样值得我们思考和进一步研究。

负链RNA病毒

之后 MVA-T7 被广泛地应用在负链 RNA 病毒的拯救（如图1.2）。随着反向遗传操作技术的成熟，2003 年，Ito 等在 Schnell 的研究基础上，利用 BSR 细胞系替代痘病毒来表达 T7RNA 聚合酶，启动 T7 启动子，进行病毒的拯救。但是因为建立细胞系的工作任务比较繁重，同年，Morimoto 等通过细胞 RNA 聚合酶 II 完成对 CMV 启动子的启动，高效的拯救出了 HEP-Flury 株狂犬病病毒，同时避免了痘病毒的使用和构建细胞系的工作，该方法虽然拯救效率高，但是具有一定的局限性，需要设计出高效特异的核酶来保证拯救事件的成功发生。虽然反向遗传研究系统已经发展的比较成熟，但是目前仍有一定的局限性，对于病毒拯救方面还需要各种条件的探索、优化。图 1.2 负链 RNA 病毒拯救系统Figure .1.2 System for the generation of negative-sense RNA viruses from clonedcDNA2.2 反向遗传技术在负链 RNA 病毒的应用反向遗传学在 RABV 基因组方面的操作使我们能够研究 RABV 更多的领域

示意图,示意图,间隔区,蛋白基因

表 1-3 RABV CVS-11 株间隔区缩短的缺失株各蛋白基因特异性扩增引物Table 1-3 Specific primers for amplification of protein genes of missing strainswith shortened spacer region of cvs-11 strain 引物序列（5’-3’）目的片F ACGCTTAACAACAAAACCAG Le+NP R TTTATCAGTGGTGTTAGTTTTTTTCATGTCTACTCCACTAACACCACTGATAAAATG M 基CTTTTGAGGGATGTTAGTTTTTTTCACATCCAAGAGGCTAACATCCCTCAAAAGACT G 基TGGATGAGAAGTGTTAGTTTTTTTCTTCACAGTCTGACTAACACTTCTCATCCAGAG L ACGCTTAACAAAAAAACAAT

【参考文献】