禽腺病毒血清4型重组株的构建及生物学特性研究

发布时间：2020-07-19 07:39

【摘要】：肝炎-心包积水综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)是由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)引起的以肝炎、心包积水为特征的疾病。自2015年以来,HHS在我国大面积流行,给我国养禽业造成了严重的经济损失。然而关于FAdV-4的毒力基因则研究较少。为探讨ORF17基因对FAdV-4复制和毒力的影响,本研究以FAdV-4流行毒株HN/15102株为亲本病毒,采用同源重组技术构建ORF17基因缺失的重组病毒。首先将表达EGFP的pΔORF17-EGFP转染已感染HN/151025的鸡肝癌细胞(LMH),构建重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP。再将EGFP表达盒去除,经蚀斑反向筛选获得rHN-ΔORF17。将rHN-ΔORF17在LMH细胞上连续传代20代,每5代进行PCR检测,结果表明rHN-ΔORF17遗传稳定。生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的生长动力学趋势基本一致,均在接种后96 h病毒滴度达到高峰。rHN-ΔORF17与亲本病毒HN/151025病毒滴度相近,分别为2.22×10~8 PFU/mL和4.26×10~8 PFU/mL,表明ORF17基因缺失不影响病毒复制能力;而rHN-ΔORF17-EGFP滴度显著下降(1.53×10~6PFU/mL)与亲本病毒HN/151025差异显著(P0.05)。中国分离株FAdV-4与加拿大ON1弱毒株相比,基因组3′端缺失1966-bp序列(ORF19和ORF27),为了解该自然缺失对病毒毒力的影响,本研究以基因组3′端35430-35431位点自然缺失1966-bp序列的HN/151025为亲本病毒,构建表达EGFP的重组病毒rHN-Δ35430-EGFP。然后将1966-bp序列替换EGFP表达盒,构建补足ON1株来源的1966-bp序列的重组病毒rHN-Δ35430-ON1。rHN-Δ35430-ON1在LMH细胞上连续传代20代,每5代进行PCR检测,结果表明rHN-Δ35430-ON1遗传稳定。重组病毒生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的复制动力学趋势基本一致,均在接种后96 h病毒滴度达到高峰。rHN-Δ35430-EGFP滴度为6.8×10~7PFU/mL,rHN-Δ35430-ON1滴度(2.66×10~8 PFU/mL)与亲本病毒HN/151025(4.26×10~8 PFU/mL)相近,说明插入1966-bp序列不影响病毒复制。对rHN-ΔORF17和rHN-Δ35430-ON1进行致病性评价。将40只28日龄SPF鸡随机分成4组,其中3组分别用rHN-ΔORF17、rHN-Δ35430-ON1和HN/151025通过滴鼻点眼途径进行攻毒,攻毒剂量为0.1 mL 8×10~5 PFU,对照组为等体积无菌PBS,攻毒后观察鸡只症状。攻毒后第3 d,rHN-ΔORF17和HN/151025组鸡只开始出现临床症状,rHN-Δ35430-ON1组鸡只于攻毒后第4 d出现临床症状,发病鸡只表现为精神沉郁、缩脖、羽毛蓬乱、喜卧嗜睡等;攻毒组发病率均为100%,发病高峰期均在攻毒后第4~6 d,攻毒后第14 d各组鸡只逐渐开始康复。攻毒组中,HN/151025组死亡率为10%,rHN-ΔORF17组死亡率为20%,rHN-Δ35430-ON1组死亡率为10%,对照组为0。对死亡鸡只进行病理剖检,攻毒组均表现心包积液、肝脏黄色坏死灶、肾肿大,无明显差异。免疫组化攻毒组肝脏均检测到抗原。攻毒后第4~28 d,每4 d采集咽肛拭子和血清抗体。咽肛拭子排毒检测中,3组攻毒组鸡只均在第4~20 d检测到100%排毒,第24 d排毒下降,3组表现一致。血清抗体检测中,整体抗体水平无差异,仅在抗体阳转率存在差异。HN/151025组阳转率最高达88.9%,rHN-ΔORF17组阳转率最高为50%,rHN-Δ35430-ON1阳转率最高为33.3%。在第32 d进行第2次攻毒,3组均无明显临床症状。抗体阳转率也无明显差异。咽肛拭子排毒,第4~27d排毒率100%,第34~55 d下降后上升,在第62 d排毒率达100%,3组表现一致,无明显差异,且均排毒反复,排毒期长。上述结果表明,2株重组病毒对鸡的致病性与亲本病毒差异不显著。综上,ORF17基因缺失和插入自然缺失1966-bp序列对病毒复制和致病性均无影响。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言4 基因组与 FAdV-1 相似，基因组编码 2 个 fiber 基因，fiber 基因带有特异性抗原决定簇，且可能与病毒毒力有关（Pallister et al., 1996; Park et al., 2017）。基因组 3′端主要编码非结构蛋白 ORF4、ORF8、ORF16-17、ORF19-20、ORF22、ORF27~30、ORF42-43、ORF48-49，大部分基因结构功能未知，有待探索。已研究过的 ORF8 编码 GAM-1 蛋白，且 FAdV-1 GAM-1 被证实为抗凋亡蛋白，其功能类似于 Bcl-2 和人腺病毒 E1B-19K，可阻断细胞凋亡（Chiocca et al., 1997）；ORF22 编码与视网膜母细胞瘤蛋白相互作用的蛋白，类似于人腺病毒 E1A 蛋白，与 GAM-1 配合激活 E2F 通路（Lehrmann et al., 1999）。

中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言存在超过 20 个突变（Li et al., 2018）。中国流行的 FAdV-4 病毒基因组 3′端存在大段基因 1966-bp序列（与 ON1 和 KR5 毒株相比）或 1964-bp 序列（与 MX-SHP95 强毒株相比）的缺失，在HN//151025毒株中，该缺失位于基因组的35430-35431位点，缺失的片段中包含ORF19和ORF27，其中弱毒株 ON1 和 KR5 毒株具有完整的 ORF19 基因，国外强毒株 MX-SHP95 的 ORF19 被分为3 段 Lip-1、Lip-2 和 Lip-3（Vera-Hernandezetal.,2016），而国内分离的强毒株均普遍缺失 ORF19基因，而弱毒株 ON1、KR5 和强毒株 MX-SHP95 均包含 ORF27 基因。由目前公布的毒株可以看出无致病性的毒株具有完整 ORF19 基因，而高致病性毒株不具有完整 ORF19 基因。同时 ORF19基因编码 Lipase 同系物，是马立克氏病病毒的毒力因子（Kamil et al., 2005），因此推测中国此次流行的高致病性 FAdV-4 主要是因为 ORF19 基因的缺失。

出无致病性的毒株具有完整 ORF19 基因，而高致病性毒株不具有完整 ORF19 基因。同时 ORF19基因编码 Lipase 同系物，是马立克氏病病毒的毒力因子（Kamil et al., 2005），因此推测中国此次流行的高致病性 FAdV-4 主要是因为 ORF19 基因的缺失。图 1.2 中国流行毒株 FAdV-4 与国外非致病性毒株基因组 3′端缺失 1966-bp 序列比对结果Figure 1.2 1966-bp sequence deletion at the 3 -end of the Chinese FAdV-4 isolates genome comparing with thenonpathogenic strains还发现 2015 年后中国 FAdV-4 分离株 ORF29 基因与 ON1 毒株相比缺失 66 bp，与 KR5 和MX-SHP95 相比缺失 33 bp（Ye et al., 2016）。除此之外，中国分离株的重复区域中还存在缺失，其中 FAdV-4 中国分离株 JSJ13，缺失 TR-1 和 TR-2（Zhaoetal.,2015）。在基因组的 3′端的 ORF17基因，强毒与弱毒存在多个位点的差异，可能与毒力相关。

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本文编号：2762126