戊型肝炎病毒跨物种侵染遗传进化及持续性感染对宿主细胞的影响

发布时间：2020-07-20 17:41

【摘要】：戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是一种引起人兽共患病的RNA病毒,HEV跨物种侵染以及持续性感染一直都是研究热点。我国是养猪大国,饲养者与猪群发生近距离接触以及猪肉制品的食用都大大增加了HEV从猪及其肉制品传播给人群的风险几率。我们利用血清学、分子生物学、细胞生物学以及生物信息学分析手段开展了猪源和人源HEV遗传进化特征以及HEV持续性感染对细胞影响的相关研究,为今后进一步开展HEV遗传进化以及宿主抗病毒机制提供参考依据。本研究首先对我国7个省份的猪群进行了HEV血清学调查。结果发现,这7个省份养猪场猪群感染过HEV的比例较高,其中育种猪是HEV传播的高风险因素,饲养猪龄在HEV传播过程中也扮演着重要作用,但是饲养猪群的地理环境不影响HEV的传播。首次从甘肃省猪群中获得genotype(gt)4e亚型HEV毒株基因组序列,这与我国目前报道的HEV在人群和猪群中流行的基因型为gt 4是相符的,这进一步说明猪源HEV对我国公共卫生存在一定威胁。鉴于较高程度HEV在猪群中的流行态势对人类健康带来的现实威胁,我们利用生物信息学方法对比了猪源和人源HEV在分子进化上的异同点,发现在同义密码子使用模式上gt 1、gt 3和gt 4 HEV毒株开放阅读框(open reading frames,ORFs)同义密码子使用模式均存在遗传学差异,但是gt 1 HEV ORF具有的同义密码子使用模式呈现出基因型特异性,这种密码子使用偏嗜性强于无论是人源还是猪源的gt 3和gt 4 HEV毒株。对于gt 3和gt 4 HEV毒株来说,猪源HEV毒株比人源HEV毒株在密码子使用模式上更加适应人和猪的密码子使用模式。这在进化层面上表明HEV在面对宿主施加的选择压力下表现出适应宿主细胞环境的进化倾向。为了进一步分析HEV在适应宿主细胞的过程中对细胞在整体生物学功能方面的影响程度,我们利用HEV持续性感染细胞模型和转录组分析手段分析了HEV持续性感染对宿主细胞的影响后发现,病毒对所侵染细胞代谢通路相关基因转录水平的影响较大,这也说明持续性感染状态下的细胞与病毒在某种程度上进行了“妥协”。然而,被感染细胞也会利用自身免疫反应来抵抗HEV对其造成的持续性感染。在检测的14种免疫基因转录水平变化中,I、II和III型IFN基因的转录水平均显著上调,以及ISG15、ISG56和MX1基因的转录水平显著升高。与此同时,我们还发现IL-6这种与抗病毒和炎症反应相关的白细胞介素在HEV持续性感染中也显著性上调了其转录水平。此外,在病毒性肝炎中具有重要免疫学活性的趋化因子CCL5和CXCL10基因转录水平显著提升,其中CXCL10基因的转录水平上调的幅度最高,说明与CXCL10相关的抗病毒免疫反应在HEV持续性感染过程中发挥着重要作用。基于上述所发现的IL-6、CCL5以及CXCL10在HEV持续性感染中转录水平的显著性变化,这为今后研究人员基于这些细胞因子作为靶点为临床治疗提供一些新的思路。本研究结果拓宽了HEV跨宿主传播过程中分子进化以及持续性感染过程中病毒-细胞互作的认知,为理解猪源HEV侵染人体所具备的遗传特征以及宿主细胞应对HEV持续性感染的各种反应机制提供了可以参考的信息。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

宿主谱,易感,系统发育分析

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）所引起的感染在世界范围内大多数临床症状表现为急性感染，每年被 HEV 所感染人口约有两千万，其中由 genotype(gt) 1 和 gt 2 HEV 毒株造成的死亡病例高达 7 万人[1]。然而，占大多数的感染病例并不表现出典型的临床症状[2]。印度目前被认为是 HEV 的发源地（二十世纪80 年代），通过流行病学分析发现 HEV 对水源的污染是造成不同于甲型肝炎(hepatitis A)和乙型肝炎(hepatitis B)的一种急性病毒性肝炎[3,4]。在 1983 年，研究人员首次通过免疫电子显微镜(immune electron microscopy)在来自于 HEV 流行疫区的志愿者粪便中观察到了 HEV 的大致形态[5]。在 1990 年，HEV 实现了分子克隆，这对于利用血清学技术的发展以及针对 HEV 大规模进行流行病学调查奠定了坚实基础[6,7]。HEV 在分类学上属于肝炎病毒科(Hepeviridae family)中 Orthohepevirus 属成员，此种病毒具有多种基因型毒株，并且易感宿主范围十分宽广（图 1.1）[8]。从图中我们可以发现，几乎所有的哺乳动物都对 HEV 不同基因型的毒株易感，gt 1 和 gt 2 HEV 主要易感宿主就是人类，而 gt 3 和 gt 4 HEV 的易感宿主谱广泛，这也是导致 HEV 成为人兽共患病的主要毒株群。

示意图,基因组,示意图,蛋白酶

甘肃农业大学 2019 届博士学位论文发生了数次裂解[42]。在这些裂解的病毒蛋白中，N 末端大小为 35kDa 的片段是利用质谱分析鉴定为甲基化转移酶。在相同的研究中，一种细胞渗透性丝氨酸酶阻遏物(cell-permeable cysteine protease inhibitor)（E-64d）可以阻止 ORF1 编码的多聚蛋白裂解，但是这种方法无法确定 ORF1 编码的多聚蛋白的裂解是受到病毒自身蛋白酶作用还是细胞自身蛋白酶的作用。

示意图,生命周期,病毒,示意图

图 1.3 HEV 病毒生命周期示意图病毒粒子富集在靶细胞表面是通过识别硫酸肝素蛋白糖来进行的（第一步）；接着结合一种尚未被鉴定出来的细胞表面受体（第二步）；HEV 病毒粒子侵入细胞内部（第三步）；病毒粒子脱壳释放 RNA 基因组（第四步）；释放出来的 RNA 在细胞质中进行非结构蛋白的表达（第五步）；RdRp 将正链 RNA基因组复制出负链 RNA 互补链（第六步）；以负链 RNA 为模板复制出长约 2.2kb 的亚基因组（第七步a）以及全长 RNA 基因组（第七步 b）；亚基因组 RNA 表达出 ORF2 和 ORF3 蛋白（第八步）。ORF2蛋白将全长子代 RNA 基因组包装成子代病毒粒子（第九步），此外 ORF3 将细胞内环境优化成为对 HEV增殖有利的内环境（第十步 a）或者细胞膜利于子代病毒出芽（第十步 b）；ORF3 对出芽的子代病毒可以协助其结合脂类物质（第 11 步）由此开始病毒对其他易感细胞的侵袭。Fig. 1.3 The life cycle of HEVStep 1: HEV particles get together to the surface of susceptible cells by heparin sulfate proteoglycans servingas attachment factors; Step 2: Viral particles bind to cells; Step 3: Viral particles are internalized; Step 4: HEVuncoats to release viral genome; Step 5: synthesize viral non-structural proteins; Step 6: RdRp replicates thepositive RNA sequence into the negative sense transcripts; Step 7: a, the negative sense strand serves astemplates for producing a 2.2 kb subgenomic RNA; b, at the same time producing the full-length viralgenome; Step 8: the subgenomic RNA expresses ORF2 and ORF3 proteins; Step 9: ORF2 protein packagesHEV genome to assemble offspring virus; Step 10: a, ORF3 protein

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