鼠伤寒沙门氏菌LPS诱导雏鸡胸腺损伤机制的转录组学研究

发布时间：2020-07-20 14:27

【摘要】：胸腺是T细胞发育的场所,其稳态的维持对免疫系统的正常发育具有重要意义。由于血-胸腺屏障的存在,胸腺曾经被视为免疫豁免器官,在感染性疾病的研究和防治工作中被忽视。近来大量的证据表明胸腺是多种病原物的靶器官。鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)是一类具有严重危害性的人畜禽共患病原微生物,该菌感染可导致雏禽多个器官损伤,甚至个体死亡。然而有关该菌感染对雏鸡胸腺的影响及其机理的研究极为匮乏。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是该菌的主要毒力因子,常用于该菌致病机制的研究。LncRNAs是近来发现的一类不编码蛋白质的长链RNA,可直接以RNA形式调控生命活动。转录组研究可以全面地反映所有RNA的表达规律和功能属性,在家禽疾病研究中发挥着越来越重要的作用。因此,本研究的目的是首先从器官、组织和细胞层面检测S.Typhimurium及其LPS刺激对雏鸡胸腺的影响,然后进一步从mRNAs和lncRNAs转录组层面系统地研究LPS刺激诱导雏鸡胸腺损伤的机制,进而为家禽细菌性疾病的防控提供理论基础。本研究取得的主要结果如下:(1)S.Typhimurium感染导致雏鸡胸腺损伤,表现为细胞大量死亡和器官萎缩。与生理盐水组相比,雏鸡胸腺皮质区细胞死亡数目在5×10~4 CFU S.Typhimurium感染后36 h达到最大值,显著增加到3.81倍(P0.05)。胸腺重量和胸腺指数在细菌感染后72 h达到最小值,分别显著下降了43%(P0.01)和26%(P0.05)。HE染色结果显示,雏鸡胸腺组织皮质和髓质分界清晰,结构完整。(2)Salmonella LPS刺激比沙门氏菌刺激更快地诱导雏鸡胸腺损伤。与生理盐水组相比,雏鸡胸腺皮质区细胞死亡数目在50 mg/kg Salmonella LPS刺激后12 h达到最大值,Formamide-MAb和TUNEL方法检测到细胞死亡数目分别显著增加到2.95倍和5.23倍(P0.001)。雏鸡胸腺质量和胸腺指数在LPS刺激后36 h达到最小值,分别显著下降了35%(P0.01)和20%(P0.05)。胸腺组织结构在LPS刺激后同样未受到破坏。此外,脾脏中chT1+细胞亚群的比例,以及脾脏和胸腺中的CD4~+/CD8~+细胞亚群的比例在LPS刺激后36 h均未发生显著变化。雏鸡胸腺髓质区和皮髓质交界处的肥大细胞数量以及皮质区的巨噬细胞标记物LEP100的表达在LPS刺激后12 h达到最大值,分别显著增加到1.90和3.69倍(P0.05)。(3)1767个雏鸡胸腺mRNAs在Salmonella LPS刺激后显著差异表达(P0.001,|log_2(fold change)|≥0.585)。Poly(A)+RNA-seq获得158978794个高质量的长50 bp的单端有效读段(clean reads),其中约77.05%的读段可以匹配到鸡的基因组。873、536和856个mRNAs的表达量在12 h vs.0 h、36 h vs.0 h和72 h vs.0 h的比较中存在显著差异。在12 h vs.0 h比较中上调mRNAs被注释到炎症反应、免疫反应等过程,以及急性时相反应信号等通路;下调mRNAs被注释到细胞分裂、染色体分离等过程,以及Polo样激酶介导的有丝分裂等通路。在36 h vs.0h比较中上调mRNAs被注释到抗菌应答、抗革兰氏阴性菌应答等过程,以及急性时相反应信号等通路;下调mRNAs被注释到着丝粒组装和染色体分离等过程。在72 h vs.0 h比较中上调mRNAs主要与代谢活动相关;下调mRNAs主要与细胞死亡、代谢和免疫活动相关。因此,在雏鸡胸腺损伤最严重的时期(12 h和36 h),差异表达的胸腺mRNAs主要涉及免疫反应和细胞分裂活动。整合通路分析结果进一步显示LPS可能通过TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路诱导雏鸡胸腺的炎症反应,进而促使DNA损伤和细胞周期阻碍。(4)鉴定了5520个雏鸡胸腺lncRNAs。rRNA-depleted RNA-seq获得385393591对高质量的长150 bp的双末端有效读段,其中约79.66%的读段可以匹配到鸡的基因组。通过读段的组装和转录本的筛选,最终鉴定了2283个基因间型lncRNAs、2810个内含子型lncRNAs和427个反义链型lncRNAs。88.59%的lncRNAs是最新发现。与鸡mRNAs相比,鸡lncRNAs的外显子较长,外显子数目较少。(5)111个雏鸡胸腺lncRNAs在Salmonella LPS刺激后显著差异表达(Q-value0.05,|log_2(fold change)|≥1)。在12 h vs.0 h比较中有47个lncRNAs差异表达,它们分别对应了1260个邻近mRNAs(cis-mRNAs)和2811个共表达mRNAs(co-mRNAs)。在36 h vs.0 h比较中有81个lncRNAs差异表达,分别对应了1766个cis-mRNAs和3203个co-mRNAs。在12 h vs.0 h比较中差异表达lncRNAs的cis-mRNAs注释于染色质沉默和蛋白激酶的负调节等过程,以及贾纳斯激酶-信号传导及转录活化因子和丝裂原活化蛋白激酶信号等通路;差异表达lncRNAs的co-mRNAs注释于细胞分裂和LPS应答等过程,以及细胞周期等通路。在36 h vs.0 h比较中差异表达lncRNAs的cis-mRNAs注释于免疫反应和细胞分裂等过程,以及卵母细胞减数分裂和贾纳斯激酶-信号传导及转录活化因子等通路;差异表达lncRNAs的co-mRNAs注释于炎症反应和细胞分裂等过程,以及细胞周期、细胞因子和细胞因子受体互作等通路。因此,在雏鸡胸腺损伤最严重的时期,差异表达的胸腺lncRNAs也主要涉及炎症反应和细胞分裂活动。通路可视化分析结果进一步显示在TLR-MAPKs-Cytokines和细胞周期通路中的大部分mRNAs均有与之共表达或者邻近的lncRNAs,因而lncRNAs也可能通过以上这些通路参与Salmonella LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程。(6)实时荧光定量PCR试验检测了22个mRNAs和6个lncRNAs的表达。为验证RNA-seq结果,将10个差异mRNAs的实时荧光定量PCR结果与Poly(A)+RNA-seq结果进行比较,二者表达趋势一致,具有显著强相关性(P=1.65e-8,r=0.828)。6个差异lncRNAs的表达模式也与rRNA-depleted RNA-seq结果基本一致,且二者同样具有显著强相关性(P=2.28e-4,r=0.871)。因而Poly(A)+RNA-seq和rRNA-depleted RNA-seq可以分别真实地反应雏鸡胸腺mRNAs和lncRNAs的表达模式。在LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程中,基因转录变化很迅速,6个mRNAs的表达量早在刺激后2~6 h显著上调。S.Typhimurium感染诱导确实可以使如上10个mRNAs的表达呈现类似的趋势,但是其峰值相对LPS刺激滞后。因此,S.Typhimurium可能主要通过LPS来影响雏鸡胸腺基因表达。除了以上10个mRNAs以外,Poly(A)+RNA-seq和实时荧光定量PCR试验均显示LPS刺激可以上调雏鸡胸腺TLR4通路和氧化应激通路中的6个mRNAs的表达,下调细胞周期6个mRNAs的表达。综上所述,本研究证明了S.Typhimurium感染及其LPS刺激均可导致雏鸡胸腺损伤。TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路在这个过程中可能起着重要的调节作用,lncRNAs也可能通过如上通路参与了LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.31
【图文】：

胸腺细胞,微环境

图 1.1 胸腺细胞微环境结构 (Anderson and Jenkinson 2001)Fig. 1.1Anatomical microenvironment of thymus (Anderson and Jenkinson 2001)1.2.2 胸腺的免疫屏障血管造影以及针对血管和淋巴样内皮细胞抗原的免疫组化试验结果显示，胸腺皮质和髓质内存在血管网络和淋巴管系统(Raviola and Karnovsky 1972, Odaka et al2006)。由于已有证据仅支持胸腺的淋巴管具有输出而非输入功能(Williams et al1971)，血管可能是外界病原物进入胸腺的潜在通道。血胸屏障是胸腺的一种防护性物理屏障，可以在一定程度上阻挡抗原分子的进入。它位于胸腺皮质区，由无通透性的血管内皮细胞、基膜和其它基质细胞组成，可阻碍大分子示踪剂通过；而髓质血管的通透性则较强，可允许各种分子量的示踪剂通过，但是进入到髓质的示踪剂不会扩散到皮质(Ribatti 2015) （图 1.2）。鸡胸腺皮质区血管有完整的基膜，髓质区的基膜是不连续的，从形态学上支持了鸡皮质

血管,胸腺,髓质,皮质

图 1.2 胸腺血管的通透性（A）皮质血管；（B）髓质血管。通过静脉给小鼠注射辣根过氧化物酶后 5 min 进行取材和染色，示踪剂的黑色的阳性信号只局限于皮质血管腔中，扩散到髓质血管外淋巴细胞的间隙(Ribatti 2015)。Fig 1.2 The permeability of vessels in thymus(A) Vessels in cortex; (B) Vessels in medulla. Sample the mice at 5 min after injected with horseradish peroxidaseand do staining, the dark positive signals were only observed in the vessel lumen in cortex (A), but outside of thevessel and around lymphocytes in medulla (B) (Ribatti 2015).1.2.3 胸腺是病原微生物的靶器官近来研究表明，胸腺可被多种病原微生物感染，如病毒、细菌、真菌和寄生虫(Savino 2006)。因此，病原微生物感染对胸腺的影响应该引起足够的重视。1.2.3.1 病原微生物感染对胸腺的影响

哺乳动物,伯氏疟原虫感染,胸腺微环境,转录组学

鼠伤寒沙门氏菌 LPS 诱导雏鸡胸腺损伤机制的转录组学研究2012)。但 S. Typhimurium SL3261 感染并不会破坏小鼠胸腺的组织结构(Ross et al2012)。此外，胸腺微环境中信号分子的表达可能被扰乱，譬如克氏锥虫和伯氏疟原虫感染均可诱导纤连蛋白、层粘连蛋白和趋化因子 CXCL12 在胸腺组织中的沉积(Cotta-de-Almeida et al 2003, Mendes-da-Cruz et al 2006, Gameiro et al 2010b)。

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