H7N9亚型禽流感病毒血凝素特异性单克隆抗体的制备及鉴定

发布时间：2020-07-22 22:45

【摘要】：H7N9亚型禽流感(Avian Influenza,AI)自2013年在我国长三角地区被发现以来,给我国养禽业带来了巨大的经济损失。通过病毒基因组的遗传演化分析和致病性研究显示,部分低致病性H7N9亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)的血凝素(HA)抗原发生了变化,已由对家禽无致病性或低致病性衍化为高致病性。此外,有文献报道指出H7N9亚型AIV能够感染人,使人出现严重的下呼吸道感染症状,对人类公共卫生安全构成严重威胁。H7N9亚型AIV通过HA吸附到易感细胞的受体,进入细胞内复制。感染的机体可以产生血凝抑制(HI)抗体。当前,单克隆抗体以其高度均质性及特异性强等特点广泛应用于疾病的快速临床诊断,因此,研制H7N9亚型AIV HA特异性单克隆抗体具有重要的应用价值。本研究以SPF鸡胚繁殖低致病性H7N9亚型AIV,加入终浓度为0.1%的甲醛溶液灭活鸡胚尿囊液,再通过超速离心去除杂蛋白,得到初步纯化的病毒。以初步纯化的灭活病毒为免疫抗原接种BALB/c小鼠,每只小鼠的每次免疫剂量为50 g病毒蛋白,共进行4次免疫。首次免疫用等体积的弗氏完全佐剂与病毒蛋白混合乳化后进行背部皮下多点注射,后续免疫均用等体积的弗氏不完全佐剂与病毒蛋白混合乳化进行背部皮下多点注射。经过4次免疫后小鼠血清间接ELISA抗体效价达到1:10000以上。取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。融合后通过间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行初步筛选,共得到166个阳性孔。为了获得针对H7N9亚型AIV HA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,又对上述阳性孔采用HI试验作进一步筛选,HI阳性的克隆用有限稀释法进行亚克隆。经过2次筛选和亚克隆,最终获得14株能针对H7N9亚型AIV HA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为 2A4、2A8、2A10、4D1、4G2、5A6、5B8、5D1、5F1、6A7、6D1、6F2、6G2 和6H8。选取HI效价大于4log2的7株杂交瘤细胞株(2A10、4G2、5A6、6A7、6D1、6F2和6G2)制备小鼠单抗腹水,并鉴定单抗亚类,结果显示,7株单抗中有4株(2A10、6A7、6F2和6G2)为IgM,3株(4G2、5A6和6D1)为IgGl。将三株分泌IgG的杂交瘤细胞株进行连续传代以检测其稳定性,结果显示,连续传代20次细胞上清HI效价未发生明显变化,说明3株杂交瘤均具有良好的稳定性。将三株IgG单抗腹水用Protein G亲和层析介质进行纯化后通过HI试验、间接免疫荧光试验(IFA)、免疫组织细胞化学试验和中和试验进行进一步鉴定。HI试验结果显示,3株单抗腹水纯化后血凝效价均大于10 log2;3株IgG亚类的单抗4G2、5A6和6D1均只与H7N9亚型AIV发生特异性HI反应,而不与H5亚型AIV、H9亚型AIV和鸡新城疫病毒(NDV)发生交叉反应;3株单抗中,4G2和5A6具有良好的广谱性,与鉴定的12株H7N9亚型AIV均能发生反应,而6D1株仅能跟其中10株病毒发生反应。间接免疫荧光试验中,3株单抗均能与H7N9亚型AIV感染的CEF细胞反应,荧光显微镜下能观察到绿色荧光。细胞免疫组化试验中,3株单抗均可在H7N9亚型AIV感染的CEF细胞中检测到AIV,显微镜下观察呈棕黄色。鸡胚中和试验中,3株单抗均可与低致病性H7N9亚型AIV反应,导致病毒丧失感染鸡胚的能力;5A6对低致病性H7N9亚型AIV的半数保护量(PD50)为10-3.42,4G2的PD50为10-282,6D1的PD50为10-2.91,具有良好的中和特性。本研究成功筛选了具有较高特异性的H7N9亚型AIV HA特异性的单克隆抗体,为后期建立H7N9亚型AIV血清学检测方法及深入研究H7N9亚型AIVHA抗原结构与功能奠定了基础。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

２禽流感病毒的基本特征逡逑ＡＩＶ属于正黏病毒科，是Ａ型流感病毒，它的基本特征主要为球状、直径８０－１２０ｎｍ、逡逑有囊膜和其内部为螺旋形的核衣壳（如图２－１所示）［１Ｍ２］。它由８个节段的负股单链ＲＮＡ逡逑组成。８个基因节段分别为ＨＡ、ＮＡ、ＮＳ、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＰＢ１和ＰＢ２，共编码１２种病毒逡逑蛋白，包括血凝素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）、神经氨酸酶（ｎｅｕｒａｍｉｄｉｎａｓｅ，邋ＮＡ）、核蛋白（ＮＰ）逡逑和基质蛋白（Ｍｌ、Ｍ２）等（如图２－２所示）［｜１’１３］。逡逑１邋Ｉ逡逑ｔｅｌ逡逑图２－１禽流感病毒电镜图片｜Ｕ］逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋Ｆｉｇｕｒｅ邋ｏｆ邋Ａｖｉａｎ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋ｖｉｒｕｓｅｓ逡逑流感病毒７０％以上组分都由蛋白质组成，以磷脂为主的脂质约占２０％，邋ＲＮＡ占１％左逡逑右，其余均为以核糖、半乳糖为主的碳水化合物。蛋白质是流感病毒粒子中最重要的组分，逡逑同时也是病毒发挥功能的主要介质。逡逑第１－３基因节段分别编码聚合酶碱性蛋白１邋（ＰＢ１）、聚合酶碱性蛋白２邋（ＰＢ２）和聚逡逑合酶酸性蛋白（ＰＡ）［Ｉ４］。它们可以形成复合体［１５１，在被病毒感染的细胞核内催化病毒ＲＮＡ逡逑的复制与转录［１４“６］。逡逑

图２－２邋ＡＩＶ的结构［ｌｌ］逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ａｖｉａｎ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋ｖｉｒｕｓｅｓ逡逑

织化学试验，实验结果显示，３株单克隆抗体均能在Ｈ７Ｎ９亚型ＡＩＶ感染的ＣＥＦ细胞中检逡逑测到ＡＩＶ并发生特异性结合，阳性细胞在显微镜下观察到棕黄色，而在未被ＡＩＶ感染的逡逑ＣＥＦ细胞中则检测不到ＡＩＶ，显微镜下只能观察到淡蓝色（如图３－２）。逡逑Ａ逦Ｂ逦１邋？逦Ｗ逡逑二气，＇逦ｉ邋…逡逑＇逦＊，．逦？逦－邋ｋ邋．逡逑／逦、逦．逦．邋Ｖ逦．夕镱、逡逑？逦＊逦■：逦－？逦Ｖ－＊逦１＊－逦＊逡逑－逦？邋ｆ逦．逦＇逦．逦．／逡逑ｍ邋＾逦－邋ａ逦、，逦？逦和、‘邋．＼逡逑亡■逡逑，：’匕，、」、“邋＇Ａ＼４４卜，广逡逑？：％－味逦”．＇、％逦＼逡逑■逦’邋．邋：ｄ邋、邋＇邋，、：逡逑图３－２细胞免疫组化结果逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＩＨＣ邋ｉｎ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ａ：对照；Ｂ：单抗４Ｇ２为一抗的免疫组化；逡逑Ｃ：单抗５Ａ６为一抗的免疫组化；Ｄ：单抗６Ｄ１为一抗的免疫组化逡逑Ａ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｂ：邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｕｓｉｎｇ邋４Ｇ２邋ＭｃＡｂ；逡逑Ｃ：邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｕｓｉｎｇ邋５Ａ６邋ＭｃＡｂ；邋Ｄ：邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｕｓｉｎｇ邋６Ｄ１邋ＭｃＡｂ逡逑３．６．８鸡胚中和试验逡逑测定低致病性Ｈ７Ｎ９亚型禽流感病毒液的ＥＩＤ５０为１（Ｔ７６７

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本文编号：2766469