定性和定量分析磺胺氯吡嗪钠可溶性粉中的未知添加物

发布时间：2020-07-22 23:50

【摘要】：定性和定量分析了一批兽药磺胺氯吡嗪钠可溶性粉中的未知添加物。使用电位滴定法对该批磺胺氯吡嗪钠可溶性粉进行含量测定,发现滴定异常,根据标准进行的两项鉴别有一项不合格,因此怀疑添加了其他化合物。采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UHPLC-Q/TOF MS)对该批样品进行筛查,发现疑似添加物,并使用高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-DAD)法进行了双重确证和含量测定。该批样品中非法添加物为乙酰甲喹和磺胺二甲嘧啶,添加量分别为40.3和16.4 mg/g。通过总结该批样品非法添加物的发现、确证和含量测定的整个过程,得出一种较好的筛查未知物的模式,为兽药处方外非法添加筛查提供可借鉴的思路。
【图文】：

滴定曲线,滴定曲线,样品,磺胺类药物

嗪钠可溶性粉，加入80ｍＬ50％（体积分数，下同）甲醇，超声5ｍｉｎ，冷却至室温，置于100ｍＬ量瓶中，用50％甲醇稀释至100ｍＬ，摇匀。精密量取5ｍＬ上述溶液置于50ｍＬ容量瓶中，用50％甲醇定容，作为ＨＰＬＣ－ＤＡＤ确证溶液。精密量取上述溶液5ｍＬ置于50ｍＬ容量瓶中，用50％甲醇定容，作为ＵＨＰＬＣ－Ｑ／ＴＯＦＭＳ筛查和确证溶液。1．3．2对照品溶液的制备分别取适量磺胺二甲嘧啶、乙酰甲喹、磺胺氯吡嗪钠对照品，用50％甲醇溶解并稀释成10ｍｇ／Ｌ的溶液，供ＨＰＬＣ－ＤＡＤ验证用。用50％甲醇稀释成图1（ａ）某实际样品和（ｂ）合格样品的滴定曲线Ｆｉｇ．1Ｔｉｔｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆ（ａ）ａｒｅａｌｓａｍｐｌｅａｎｄ（ｂ）ａｑｕａｌｉｆｉｅｄｓａｍｐｌｅ100μｇ／Ｌ的溶液，供ＵＨＰＬＣ－Ｑ／ＴＯＦＭＳ确证用。2结果与讨论2．1未知物的发现和初步分析参照《中国兽药典》［22］用电位滴定法对该批磺胺氯吡嗪钠可溶性粉样品进行含量检测时，无法滴定至终点，且与合格样品的滴定曲线差异甚大（见图1）。进行两项鉴别时，芳香第一胺类试验鉴别合格，但薄层色谱鉴别中对照品溶液与供试品溶液的斑点位置和颜色有极微小差别，鉴别不合格。推测样品中含其他磺胺类药物，也可能含有其他非法添加物。2．2未知物的推断使用ＵＨＰＬＣ－Ｑ／ＴＯＦＭＳ对该批样品进行一级质谱数据采集，图2ａ为总离子流色谱图（ＴＩＣ），在5.366和5.668ｍｉｎ有2个明显的峰，对峰1和峰2分别进行质谱提取，检测到在ｍ／ｚ279.0907和219.0765两处响应明显更强（见图2ｂ和图2ｃ）。因鉴别试验中有芳香第一胺类反应，样品中含有磺胺类药物的概率较大。首先在磺胺类药物ＰＣＤＬ库中进行匹配；发现磺胺二甲嘧啶和磺?

总离子流,质谱,色谱图,样品

液，供ＵＨＰＬＣ－Ｑ／ＴＯＦＭＳ确证用。2结果与讨论2．1未知物的发现和初步分析参照《中国兽药典》［22］用电位滴定法对该批磺胺氯吡嗪钠可溶性粉样品进行含量检测时，无法滴定至终点，且与合格样品的滴定曲线差异甚大（见图1）。进行两项鉴别时，芳香第一胺类试验鉴别合格，但薄层色谱鉴别中对照品溶液与供试品溶液的斑点位置和颜色有极微小差别，鉴别不合格。推测样品中含其他磺胺类药物，也可能含有其他非法添加物。2．2未知物的推断使用ＵＨＰＬＣ－Ｑ／ＴＯＦＭＳ对该批样品进行一级质谱数据采集，图2ａ为总离子流色谱图（ＴＩＣ），在5.366和5.668ｍｉｎ有2个明显的峰，对峰1和峰2分别进行质谱提取，检测到在ｍ／ｚ279.0907和219.0765两处响应明显更强（见图2ｂ和图2ｃ）。因鉴别试验中有芳香第一胺类反应，样品中含有磺胺类药物的概率较大。首先在磺胺类药物ＰＣＤＬ库中进行匹配；发现磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲异嘧啶的［Ｍ＋Ｈ］＋与ｍ／ｚ279.0907匹配，两者的分子式均为Ｃ12Ｈ14Ｎ4Ｏ2Ｓ，但磺胺二甲异嘧啶的出峰时间为4.771ｍｉｎ，与供试品不匹配，而磺胺二甲嘧啶出峰时间为5.334ｍｉｎ，与供试品匹配，推测该化合物为磺胺二甲嘧啶。另一个离子在已经建立的一级数据库中进行匹配，发现乙酰甲喹的［Ｍ＋Ｈ］＋与ｍ／ｚ219.0765匹配，且保留时间一致，匹配分数为98.26，推测该化合物为乙酰甲喹。图2（ａ）样品总离子流色谱图及（ｂ）峰1和（ｃ）峰2的质谱提取图Ｆｉｇ．2（ａ）Ｔｏｔａｌｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅａｎｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍ（ｂ）ｐｅａｋ1ａｎｄ（ｃ）ｐｅａｋ22．3未知物的确证2．3．1ＵＨＰＬＣ

磺胺氯吡嗪钠,可溶性粉,二级质谱,化合物

第5期包爱情，等：定性和定量分析磺胺氯吡嗪钠可溶性粉中的未知添加物图3磺胺氯吡嗪钠可溶性粉中疑似化合物的二级质谱图Ｆｉｇ．3ＭＳ／ＭＳｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｈｅｓｕｓｐｅｃｔｅｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｓｕｌｆａｃｈｌｏｒｐｙｒａｚｉｎｅｓｏｄｉｕｍｓｏｌｕｂｌｅｐｏｗｄｅｒ甲喹的精确［Ｍ＋Ｈ］＋）为母离子进行二级质谱采集的谱图。另取磺胺二甲嘧啶和乙酰甲喹对照品溶液（100μｇ／Ｌ）在相同的条件下采集二级质谱。对照品图谱与供试品图谱几乎完全一致，匹配值高达99.26和99.58，表明非法添加的化合物为磺胺二甲嘧啶和乙酰甲喹。2．3．2ＨＰＬＣ－ＤＡＤ确证在液相保留时间和紫外光谱两方面将样品与对照品进行比对。通过不同浓度本底添加峰纯度检查和光谱相似度检查对样品中的未知物进行确证。样品在该试验条件下检出2个较大的未知色谱峰，与该条件下乙酰甲喹和磺胺二甲嘧啶对照品的保留时间一致，紫外光谱相似；同时发现该批样品中未检出标示的磺胺氯吡嗪钠（见图4）。不同浓度（取与供试品溶液峰面积相当的对照品溶液与之混合，对照品溶液与供试品溶液按体积比1∶4、1∶1和4∶1混合）的本底添加试验峰纯度检查结果显示：添加前后，样品色谱图相应位置上的色谱峰纯度值大于纯度阈值，为单一物质峰。光谱相似度检查结果显示：添加前后，样品色谱图相应位置上色谱峰的光谱匹配度高于匹配阈值，与对照品的光谱相似。验证结果及峰纯度检查、光谱相似度检查结果见表1。2．4含量测定经上述ＵＨＰＬＣ－Ｑ／ＴＯＦＭＳ和ＨＰＬＣ－ＤＡＤ双重验证，确证供试品中含有乙酰甲喹和磺胺二甲嘧啶，这两种非法添加物在农业部2448号公告［23］中均已涉及。公告中氟喹诺酮类制剂中非法添加乙酰图4（ａ）混合对照?

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