携带有犬瘟热与犬细小病毒抗原的腺相关病毒载体疫苗的构建

发布时间：2020-07-23 06:03

【摘要】：犬瘟热病毒与犬细小病毒可以引起犬科、鼬科、大熊猫科等动物的烈性传染疾病,引起动物的死亡率可高达80%,给我国宠物饲养业、皮毛动物饲养业、野生动物保护领域均带来了严重的经济损失。目前国内外主要使用犬瘟热与犬细小病毒的弱毒疫苗对疾病进行防控,但该种类疫苗存在一些不足之处,例如生产成本比较高,弱毒疫苗具有毒力返强的隐患,面对不同的病毒变异株有其局限性等。本研究旨在构建一款高效安全低成本的新型疫苗。我们通过将犬瘟热与犬细小病毒的抗原基因插入到腺相关病毒(Adeno associated virus,AAV)基因组中,制备成可预防犬瘟热与犬细小疾病的腺相关病毒重组疫苗。本课题首先选择犬瘟热病毒的血凝蛋白基因、融合蛋白基因和犬细小病毒的衣壳蛋白基因作为抗原基因,并分别插入到腺相关病毒基因组中。再通过腺相关病毒三质粒包装系统获得携带各抗原基因的重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)。经病毒滴度检测与外源蛋白表达检测后,将携带有犬瘟热与犬细小病毒抗原基因的rAAV混合,通过肌肉注射免疫6周龄的Balb/c小鼠,同时以英特威犬二联疫苗作为阳性对照,以rAAV-GFP病毒作为阴性对照。在首次免疫实验中,按照英特威犬二联疫苗的免疫程序免疫,即对小鼠进行三次免疫,每次免疫间隔14 d。免疫程序结束后每隔14 d对小鼠进行采血与中和抗体的检测。我们得到了良好的实验结果,之后为了进一步验证rAAV疫苗的高效性,按照与三次免疫实验相同的免疫途径与免疫剂量对实验小鼠进行一次免疫实验,免疫后继续监测中和抗体水平。三次免疫结果显示rAAV疫苗可以使小鼠产生高水平的中和抗体。在免疫后所有时间点中rAAV疫苗使小鼠产生的抗犬瘟热病毒中和抗体效价均高于阳性对照,最高时中和抗体效价大于1:500,是阳性对照的4倍。但在免疫后的所有时间点中,rAAV疫苗使小鼠产生的抗犬细小病毒中和抗体效价均与阳性对照接近,中和抗体效价均在1:100到1:200之间,一般认为当中和抗体效价大于1:100时机体便可以免受强毒的攻击。一次免疫结果显示rAAV疫苗依然可以使小鼠产生高水平的中和抗体。在免疫后第6周rAAV疫苗使小鼠产生的抗犬瘟热病毒中和抗体效价超过1:100,然而阳性对照产生的抗犬瘟热病毒中和抗体效价始终小于1:100,理论上我们认为阳性对照免疫失败,在免疫后第8周rAAV疫苗与阳性对照使小鼠产生的抗犬细小病毒中和抗体效价均超过1:100。在此次免疫实验中显示,rAAV疫苗仅需要对动物进行一次免疫,理论上就可以达到对动物的有效免疫。本研究的结果表明:rAAV疫苗可以激发小鼠的免疫系统并产生高水平的中和抗体;rAAV疫苗仅需对动物进行一次免疫在理论上就可以达到对动物的有效免疫;rAAV疫苗针对于犬瘟热病毒和犬细小病毒产生的免疫效果不平衡,针对于犬瘟热病毒的免疫效果强于针对犬细小病毒的免疫效果,这种现象可能是由抗原的选择、rAAV病毒混合的比例与滴度等原因造成的,可在后续工作中继续摸索病毒配比条件以更好的平衡针对两种病毒的免疫效果。综上所述携带有犬瘟热与犬细小病毒抗原基因的腺相关病毒重组疫苗具有安全高效、缩短免疫周期、成本低廉等优势,有望成为有效防控犬瘟热与犬细小疾病的新型疫苗。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

犬瘟热病毒,结构模式

1-1 犬瘟热病毒结构模式图（Fuxiao Liu et al 201Structure of Canine Distemper Virus（Fuxiao Liu et的诊断

包装系统

图 1-3 rAAV 包装系统Fig. 1-3 rAAV Packaging System的应用型病毒，现阶段没有 AAV 导致人类疾病胞内部稳定表达外源基因，并且 AAV 相对和，不同血清型的 AAV 更扩大了 AAV 的来 AAV 在基因治疗领域和基础研究领4）。相关病毒首次应用于治疗囊性纤维化的临，欧洲批准了基因疗法药物 Glybera，药物关病毒，通过注射药物入患者的腿部肌肉er 2012）；2017 年 10 月，以 AAV 为载体

质粒图谱,教授课题,华中农业大学,实验室

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【参考文献】