猪源噬菌体抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选

发布时间：2020-07-23 02:36

【摘要】：中和抗体能够与病毒表面的抗原结合,从而阻止病毒吸附靶细胞受体,防止病毒侵入细胞,在抗病毒感染中发挥重要作用。因此,中和抗体是一种具有很好应用前景的抗病毒治疗制剂。但是,采用小鼠单克隆抗体技术制备的抗病毒中和抗体对于人或畜禽等动物存在异源性等特性,导致其临床应用受到限制。近年来,随着抗体制备技术的发展,制备人源或动物源的中和抗体成为研究热点。目前,针对人类免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、登革热病毒等多种病毒的全人源中和抗体开发取得了显著进展,而且还发现人体内可能存在具有抗病毒中和作用的天然中和抗体。相对于人源中和抗体研究,猪等动物源中和抗体的开发尚处于起步阶段。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的妊娠母猪繁殖障碍、仔猪严重呼吸系统症状和生长迟缓等临床表现的病毒性传染病。PRRSV感染或免疫能诱发很强的体液免疫反应,一般于感染后7~9 d可检测到特异性抗体,但这些抗体对体内、外的病毒都没有中和能力甚至会增强感染,而有效的中和抗体一般出现于28 d以后。由于中和抗体产生的时间晚、水平低,使该病的防治十分困难。为深入研究猪对PRRSV的抗体反应,本研究利用噬菌体展示技术构建了猪源抗体库,并从中筛选到具有中和能力的抗体。进一步研究发现筛选到的中和抗体为多反应性抗体,主要结合细胞蛋白KRT8(Keratin 8)和MYH9(Nonmuscle myosin heavy chain II-A)。具体研究内容如下:1.猪源天然抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选分离PRRSV抗原、抗体阴性猪的PBMCs(Peripheral Blood Mononuclear Cells),提取mRNA,利用RT-PCR技术扩增得到抗体重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因,通过overlap PCR将VH、VL用一条柔性多肽基因组装成scFv(single-chain antibody)片段。噬粒pComb3XSS与scFv片段经Sfi I酶切、回收、连接、电转化感受态细胞,获得库容为1.5×10~8的初级库,经鉴定插入片段大小的正确率为80%。通过测序发现VH序列的相似度介于63.3%~92.5%,未发现相同序列,说明抗体库的多样性好。与IMGT数据库比对发现天然库VH基因家族的分布符合文献报道的最多的3个基因家族占比40%,最多的6个基因家族占比70%的规律,而且天然库的VH基因分布于13个不同的基因家族,进一步证实构建的天然库具有很好的多样性。加入辅助噬菌体超感染获得重组噬菌体抗体库,用纯化的PRRSV病毒粒子进行筛选,获得4株噬菌体抗体N-28、N-36、N-48、N-67。将获得的抗体基因连接至pET-22b表达载体,经鉴定重组蛋白主要以包涵体的形式表达。对包涵体进行变性、复性后,测定了4株抗体中和PRRSV的能力,发现其中N-28、N-67具有一定的中和PRRSV的能力。2.猪源PRRSV免疫抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选为筛选具有广谱抗PRRSV的中和抗体,首先用PRRSV商品化弱毒活疫苗免疫30日龄仔猪,然后用高致病性PRRSV毒株(WUH3株)、两种美国流行毒株(VR2385、VR2549)、国内分离的流行毒株(NADC30L)对仔猪进行感染。经过8次免疫/感染后,实验猪体内产生了针对PRRSV WUH3株、VR2385株、VR2549株和NADC30L株的高滴度中和抗体,中和效价介于1∶63.5~1∶858.7之间。分离高免疫猪的PBMCs,扩增抗体基因,经过多次电转获得库容为2×10~7的初级库,经鉴定插入片段大小的正确率为89.4%。通过测序发现VH序列的相似度介于70.3%~93.5%,未发现相同序列,说明免疫抗体库的多样性好;VH基因家族则由天然库的13个下降为6个,说明经过多次免疫/感染后试验猪的抗体基因使用率发生了明显的变化。用纯化的PRRSV病毒粒子对构建的抗体库进行富集、筛选,最终获得3株噬菌体抗体I-2154、I-1320、I-141。将抗体基因连接至原核表达载体pET-22b中,表达纯化后测定了3株抗体对PRRSV WUH3株、VR2549株、NADC30L株的中和能力,结果表明3株抗体对3株病毒均有一定的中和作用,其中I-141的中和效果最好。3株病毒对抗体的敏感度也不相同,其中NADC30L对I-141最为敏感。进一步分析了I-141对NADC30L的抑制机制,发现I-141并不影响病毒的吸附而是抑制了病毒的侵入。3.scFv结合蛋白的质谱鉴定与功能研究首先用生物素标记的N-28、I-141分别与感染或不感染PRRSV的MARC-145细胞裂解液孵育,用链霉亲和素偶联的磁珠分离与scFv结合的蛋白,然后对分离的蛋白进行了质谱鉴定。根据质谱结果检索PRRSV WUH3编码蛋白,在2个接毒组中均未能鉴定到病毒蛋白;对4个实验组鉴定到的蛋白分析发现有30种蛋白在4个实验组均能被鉴定到,提示N-28、I-141可能为多反应性抗体。为了确认这两株scFv的多反应性,选择了KRT8、MYH9这两种已知在病毒感染细胞过程中发挥重要作用的蛋白作为研究对象,通过免疫共沉淀实验发现N-28、I-141能与KRT8、MYH9发生互作,确认了这两种scFv的多反应性。然后在PK-15~(CD163)细胞中干扰或超表达这两种蛋白,证实这两种蛋白参与了PRRSV的感染,并且在PRRSV侵入细胞过程中这两种蛋白的表达量上调。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

重链,亚类,轻链,恒定区

尽管抗体分子有不同的类和亚类，是一种极不均一的分子群，而且能结合不同的抗原，但所有的抗体分子都有着相似的基本结构，都由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，轻、重链内和链间通过二硫键连接(Edelman 1959)。轻链的分子量约为 25kD，重链的分子量在 50kD～70kD 之间(Edelman et al 1969)。轻链有两种类型：kappa（）链和 lambda（）链，它们构成抗体分子的比例在不同物种间是不同的，小鼠抗体为 20：1，人抗体约为 2：1，而猪抗体接近 1：1(Butler et al 2005)。重链有5 种类型：、、、、，分别决定了抗体的 5 中类别：IgM、IgD、IgG、IgA、IgE(Maand O'Kennedy 2015)。其中有的类别还有亚类，如鼠 IgG 可分为 4 个亚类：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，人的IgG也可分为4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4(Schroeder et al 2010)。轻、重链的氨基端约 110 个氨基酸变异很大被称为可变区（variable region，V），其余部分变化不大为恒定区（constant region，C）(Schroeder et al 2010)。可变区与特异性识别抗原有关，而恒定区则参与免疫应答具有许多生物学效应。同一物种、图 1-1 抗体分子结构 (Roitt I et al 2010)Fig. 1-1 Antibody molecules structure

核图,结构模式,图表,图谱

华中农业大学 2018 届博士研究生学位论文Lunney et al 2016)，位于编码区 5 端的 ORF1a 和 ORF1b 先翻译出两个聚蛋白前体pp1a 和pp1ab，随后经酶解得到 16个非结构蛋白：nsp1 ，nspnsp7 ，nsp7 ，nsp8-12；以及新发现的 nsp2TF，nsp2N(Fang et al 2012, Li)。与其它的动脉炎病毒一样，PRRSV 通过不连续转录机制合成 6 个亚基RNAs（sub genome RNA，sg mRNAs），sg mRNAs 具有相同的 5 端先导3 末端。PRRSV 的 sg mRNAs 编码病毒的 8 个结构蛋白；其中 GP2a、GP3P5 为与囊膜有关的糖基化蛋白，E、ORF5a、M 为非糖基化蛋白，N 为核图 1-3）(Snijder et al 2013, Kappes and Faaberg 2015)。

噬粒,载体,图谱

RRSV 抗原、抗体阴性的断奶仔猪，为英山地方品种猪，购自、毒株、疫苗与菌株肾传代细胞（MARC-145）为本实验室保存。163细胞为西北农林科技大学周恩民教授惠赠。 WUH3 株、NADC30L 株为本实验室分离并保存，PRRSV V自 ATCC。PRRSV 商品化弱毒疫苗 Ingelval PRRS MLV、JXA1病预防控制中心。 DH5 、BL21（DE3）由本实验室保存，大肠杆菌 XL1-blue 由物学国家重点实验室彭贵清教授惠赠。与质粒T 克隆载体购自大连宝生物（TaKaRa）公司。omb3XSS，由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室彭贵。载体 pET-22b、真核表达载体 pCAGGS-Flag 由本实验室保存。

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