宿主因子CypB促进羊传染性脓疱病毒复制机制的初步研究

发布时间：2020-07-23 18:55

【摘要】：羊传染性脓疱病是由传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染引起以绵羊、山羊为主的一种急性、高度接触性传染病。以在患羊口唇等部位的皮肤或黏膜形成红斑、脓疱等病变为主要特征。同时,它也是一种重要的人兽共患病。课题组前期研究发现,宿主因子亲环蛋白B(Cyclophilin B,Cyp B)能够促进ORFV的复制增殖。然而,Cyp B在ORFV侵染过程中发挥怎样的生物学功能,而ORFV又是如何利用Cyp B促进其复制增殖并完成侵染的过程尚不明确。因此,本研究对Cyp B在ORFV侵染过程中潜在的生物学功能进行探讨分析,并利用免疫共沉淀技术对与Cyp B互作的病毒蛋白或蛋白质分子群进行筛选。为明确Cyp B在ORFV侵染过程中潜在的生物学功能,首先利用激光共聚焦显微镜对Cyp B在感染前后宿主细胞中的定位分布情况进行检测;同时制作细胞超薄切片,利用透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化以及Cyp B蛋白的定位分布,结果显示,Cyp B主要分布在MDBK细胞的粗面内质网上。之后,应用内质网红色荧光探针ER-Tracker Red进行荧光标记,利用激光共聚焦扫描显微镜观察Cyp B在亚细胞水平上的定位分布,结果显示,在ORFV感染的宿主细胞中,Cyp B与内质网存在明显的共定位现象,该结果进一步证实Cyp B主要定位分布于MDBK细胞的粗面内质网。利用特异性抑制剂环孢菌素A(Cs A)改变Cyp B的顺反异构酶活性,探讨其活性改变对ORFV感染宿主细胞能力的影响。利用Western-blot检测在ORFV早期感染MDBK细胞中加入不同浓度Cs A对Cyp B表达的影响,结果显示,随着Cs A浓度的增加,Cyp B的表达量逐渐下降,该结果表明Cs A能够抑制Cyp B的表达。利用Real-time PCR检测加入不同浓度Cs A对病毒复制的影响,结果显示,在低剂量药物浓度范围内,Cs A不仅能够抑制Cyp B的表达,而且同时抑制ORFV在宿主细胞中的复制增殖。上述结果进一步证实Cyp B是ORFV侵染过程中的重要辅助因子,能够促进ORFV复制。然而,ORFV是如何利用Cyp B促进其复制增殖并完成侵染的过程尚不清楚。因此,本研究利用免疫共沉淀技术筛选与Cyp B互作的蛋白。免疫共沉淀产物的SDS-PAGE和Western-blot的分析结果显示,在大小约为25 k D处可见有明显的差异条带。切下该差异蛋白条带进行质谱鉴定分析,将获得的原始质谱数据使用Mascot软件中的串级质谱数据搜索功能(MS/MS Ions Search)进行搜索鉴定,初步筛选获得6个可能与Cyp B相互作用的病毒相关蛋白。上述研究结果将不仅为从病毒与宿主互作角度阐明ORFV的致病分子机制奠定基础,也为利用Cyp B途径阻断ORFV的感染提供有价值的资料。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

第二篇 研究内容 第 1 章 CypB 在 ORFV 早期感染宿主细胞中的亚细胞定位1.3 结果1.3.1 免疫荧光标记观察结果正常 MDBK 细胞接种 ORFV 4h 后制成细胞爬片，同时制作未接毒的正常MDBK 细胞爬片作为对照。应用间接免疫荧光染色法，利用激光共聚焦显微镜初步观察 CypB 蛋白在 ORFV 早期感染 MDBK 细胞前后的定位分布情况。结果显示无论病毒感染前（图 1.1）后（图 1.2）在 MDBK 细胞的胞浆中均可见较亮的绿色荧光，部分细胞核位置出现较暗绿色荧光。

MDBK 细胞爬片作为对照。应用间接免疫荧光染色法，利用激光共聚焦显微镜初步观察 CypB 蛋白在 ORFV 早期感染 MDBK 细胞前后的定位分布情况。结果显示无论病毒感染前（图 1.1）后（图 1.2）在 MDBK 细胞的胞浆中均可见较亮的绿色荧光，部分细胞核位置出现较暗绿色荧光。图 1.1 正常 MDBK 细胞内 CypB 的分布定位（标尺: 10μm）A: 细胞核荧光显色 B: CypB 蛋白荧光显色 C: 合并显色Fig.1.1 Fluorescent photos of normal MDBK cells (Scale bar = 10μm)A, Fluorescent photos of cellular nucleus; B, Fluorescent photos of CypB; C, Merge

第二篇 研究内容 第 1 章 CypB 在 ORFV 早期感染宿主细胞中的亚细胞定位早期感染 MDBK 细胞前后的定位分布情况。结果显示病毒感染前（图 1.3 箭头所示）或病毒感染后（图 1.4 箭头所示）在 MDBK 细胞的粗面内质网上均可见较多胶体金颗粒。

【参考文献】

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本文编号：2767710