我国活禽市场抗生素抗性基因的多样性及生态学分布规律研究

发布时间：2020-07-24 03:10

【摘要】：近年来,抗生素耐药性已经成为了一个危害公共卫生和食品安全的全球性问题。抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)可以通过水平转移和垂直传播在动物、环境和人之间循环。活禽市场作为一个交易地点,大量的动物在市场被频繁的转运,不仅促进了病毒的传播,也促进了耐药基因和耐药菌的传播。但ARGs在我国活禽市场环境中的生态学分布规律目前尚不清楚,因此有必要开展典型活禽市场环境中ARGs的多样性及分布特征和活禽肠道菌群多样性研究。本文针对这个问题开展研究,选取我国活禽市场作为研究对象,通过大规模的样本采集调查,利用宏基因组学测序深入研究ARGs在活禽市场的污染特征和活禽肠道微生物的多样性,并与猪、人和小鼠的参考基因集进行比较分析,主要内容如下:首先,对长期进行流感病毒监测的活禽市场进行采集样本调查研究。选取我国18个省和自治区中的26个活禽市场,采集多种活禽的新鲜粪便,通过非培养的方法直接提取样本中的总DNA,并利用Illumina平台进行高通量测序。通过对测序数据进行全面生物信息学分析,共有102只鸡的肠道菌群及功能多样性。结果显示,鸡的肠道菌群中90.71%以上是细菌,在各分类水平上分属于16个门、30个纲、48个目、110个科、213个属和433个种。通过与已知的猪、人和小鼠肠道参考基因集比较,发现四组的肠道菌群基因集差异巨大,两两之间有一定的重叠,但四者共有的基因占各自基因集的比例较低。在基因水平,鸡的肠道微生物基因比人和小鼠具有较高的α多样性,但低于猪的菌群基因α多样性;在KO水平,鸡比猪和人的微生物具有较低的α多样性。相对而言,鸡、猪、人和小鼠的肠道微生物在功能层面上展现了较高的相似性;功能水平上,鸡、猪、人和小鼠的KO功能有很大比例的重叠(4316个KO,占总KO的50.1%)。其次,对测序数据进行耐药基因注释,结果表明,ARGs广泛分布于所有的活禽市场,共有235种耐药基因型,而且南方市场中检测到的ARGs数量显著多于北方。在测序的130份活禽样本中,共有71份样本携带有多粘菌素抗性基因mcr-1,利用PCR技术对活禽市场中mcr-1的分布进行进一步验证,发现mcr-1基因有很高的阳性率(59.63%)。此外,在我们的样本中还发现了mcr-3 mcr-4、mcr-5和NDM-1等高风险基因。最后,通过比较分析活禽、猪、人和小鼠的参考基因集,结果表明,活禽与猪、人和小鼠共享很多种ARGs,而且有43种ARGs在4组样本中是共有的,总体而言,ARGs在4组样本中的种类分布差异比较大,活禽中ARGs的数量和丰度均显著高于猪、小鼠和人,值得注意的是,四环素类耐药基因在四组中均是最丰富的。综上所述,携带各种ARGs的活禽被运到活禽市场进行频繁交易;多粘菌素耐药基因mcr-1在活禽市场样本中有很高的阳性率;不同活禽之间的ARGs有很高的共享率,提示ARGs有可能是由于在活禽市场中交叉传播导致;有多种ARGs在人、猪、小鼠和活禽的肠道微生物中也是共享的;但在基因水平具有较少的相同基因,在功能水平具有更多相同的代谢通路。本文通过宏基因组学方法,从深度测序的角度揭示了 ARGs和肠道微生物在不同物种和地区之间的差异特征,对公共卫生的防控及食品安全的评估具有重要的意义。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.796
【图文】：

抗生素耐药,微生物群落

扬州大学硕士学位论文学及其在细菌耐药方面研究的应用逡逑大多数的环境微生物是无法通过纯培养的方法得到，为研究耐药况及生态学分布规律，需要采用不需要培养的宏基因组学方法。接克隆的方法对环境微生物总ＤＮＡ进行整体研究，是由Ｈａｎｄｅｌ提出来，这种方法不需要分离培养微生物，可以克服传统的培养方法局限性，通过构建文库、高通量测序，筛选已知和未知的耐药基资源［４２］，还可以对环境样本中的活性物质进行筛选［４３４５］。目前宏列分析和功能筛选两个方向（图１）。序列分析主要是针对环境中，分析该环境中微生物的组成和相关功能。对环境中的耐药基因耐药机制，为控制其传播和研发新的抗生素提供指导。通过这两方肠道微生物的结构和功能基因组，从而为深入探索肠道菌群的代。逡逑

分布图,采样点,分布图,湿热灭菌

主要相关试剂逡逑提取试剂盒：德国Ｓｔｒａｔｅｃ邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ＧｍｂＨ。逡逑Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ邋ＤＮＡ邋Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ。逡逑Ｎａｍｐ邋Ｂａｃｔｅｒｉａ邋ＤＮＡ邋Ｋｉｔ邋0逡逑试剂逡逑称取１００ｍｌ的甘油和１００ｍｌ的蒸馏水混匀，１２１°Ｃ湿热灭菌３０ｍｉｎ。逡逑ＣａＣｈ：称取ｌ．ｌｌｇ的ＣａＣｈ放入１００ｍｌ烧杯中，加入９０ｍｌ的蒸馏水定容到ｌ00ｍｌ，１２１°Ｃ湿热灭菌３０ｍｉｎ。逡逑ｆｆｅｒ：邋２ＭＴｒｉｓ－醋酸，ｌＯＯＭｍＥＤＴＡ，ＰＨ邋８．５，室温保存。逡逑凝胶：称取０．８ｇ琼脂糖用１００ｍｌ的ｌｘＴＡＥ用微波炉中加热充分溶解事先洗干净的制胶槽，然后插入合适的梳子，待其凝固后使用。逡逑

曲线,曲线,基因,微生物

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｓｐａｒｓｅ邋ｃｕｒｖｅ逡逑和小鼠肠道微生物中基因的异同逡逑小鼠肠道微生物中仅有很少一部分基因（９０３７个）２％邋（猪）、０．０９％邋（人）和０．３６％邋（小鼠）。基因在的重叠（禽对猪，９４３１５个基因；禽对人，９０８４８３个１－３）。逡逑２３＆＊８４５逦６３９９９７６逡逑资ＳＴ：．逦２１２１逡逑８９０５６逦３Ｓ？７Ｓ逡逑ＷＩ０逦１．１１７逡逑８０２９３２１逦７３９９２２６逡逑９０３７逡逑７３５０７７ｒ邋Ｖ＊逦７＞８１逡逑４／Ｍ６逦２１３；＞逡逑Ｂ３００８Ｓ逡逑

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