肉牛呼吸道疾病综合征的病原检测和IBRV恒温隔绝式荧光PCR方法的建立与应用

发布时间：2020-07-24 21:49

【摘要】：牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)是一类对养牛业造成严重危害和经济损失的疾病。引起BRDC的病因复杂、病原繁多,包括病毒、细菌和支原体等,运输应激和环境改变等因素是重要诱因。近年来,BRDC已经成为制约国内肉牛养殖的一个重要问题。本研究的目的是调查四川BRDC爆发的肉牛群中病原流行情况,分离鉴定牛传染性鼻气管炎病毒并建立可现场检测该病毒的荧光PCR方法,为肉牛BRDC的防控提供参考,取得了以下成果:1.肉牛呼吸道疾病综合征的病原检测2016年10月~2018年3月,采集了四川省爆发BRDC的11个肉牛场108份深部鼻腔棉拭子,采用PCR方法分别检测牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhoea Virus,BVDV)、牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCoV)、牛副流感3型病毒(Bovine Parainfluenza Virus type 3,BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine Respiratory Syncytial Virus,BRSV)、牛腺病毒3型(Bovine Adenovirus type 3,BAV3)、牛支原体(Mycoplasma bovis,M.Bovis)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,M.haemolytica)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.multocida)和睡眠嗜组织菌(Histophilus somni,H.somni)等10种病原,并鉴定M.haemolytica的荚膜血清型。检测结果显示IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni的阳性率分别为37%、16.7%、4.6%、5.6%、6.5%、24.1%、6.5%、46.3%、5.6%,BRSV未检出;不同牛场检出的病原种类有所差别,但IBRV、M.Bovis和M.haemolytica的平均阳性率和场阳性率较高,且混合感染较严重。荚膜血清6型和1型是M.haemolytica的优势荚膜血清型(38/50)。本研究结果为国内肉牛BRDC的防控提供了参考。首次从国内BRDC样本中检测到H.somni,丰富了国内BRDC的病原谱。2.牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定挑选10份IBRV阳性样本,采用MDBK细胞进行分离鉴定。接种后盲传至4代时,其中一个样本接种的细胞出现细胞圆缩、拉网、聚集成葡萄串样的细胞病变,传至5代后,细胞病变稳定。经PCR方法和间接免疫荧光鉴定,确定该毒株为IBRV,命名为IBRV/2018/SMU6352。空斑纯化后该毒株的病毒滴度为10~(8.25)TCID_(50)/mL。自行设计引物扩增获得了分离毒株的完整gB和gC基因序列(GenBank登录号分别为MK654723和MK654724)。基于gB的遗传进化显示该毒株为IBRV-1.2型。与GenBank中2019年3月18日前登录的全部55条完整的IBRV gB基因序列(包括唯一国内完整序列JN787952)比对发现,该毒株gB基因序列在1576-1577位插入6个核苷酸(GCGACG),导致其氨基酸序列525-526之间插入两个氨基酸(GD)。该插入发生在gB蛋白胞外区,不在T细胞和B细胞识别位点区域,首次在国内IBRV gB基因上发现这种突变现象。与GenBank中2019年3月18日前登录的全部56条完整的IBRV gC基因序列(包括唯一国内序列JN787953)比对发现,该毒株gC基因核苷酸序列存在5个独特的非同义替换(T614C、C712T、A833G、A1190G、A1247G),导致该蛋白出现5个独特的氨基酸序突变(V205A、R238C、Q278R、E397G、E416G),可能会影响gC蛋白的免疫原性和该蛋白与细胞肝素样受体结合能力。本实验首次在国内报道分离得到IBRV-1.2型毒株,且该毒株gB和gC氨基酸序列上存在独特的变异,为了解国内IBRV的遗传进化提供了参考,也为进一步的IBRV疫苗研发奠定了基础。3.检测IBRV的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立与应用IBRV是OIE和我国进出口及跨省贸易中要求检疫的病原,但目前还未见可用于现场的PCR检测方法。参考OIE推荐的荧光定量PCR方法的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了基于恒温隔绝式荧光PCR(Insulated isothermal PCR,iiPCR)检测IBRV的方法。结果显示该方法只特异性检出IBRV,而对BVDV、BPIV3、BRSV、BAV3、BCoV、M.Bovis、P.multocida和M.haemolytica等无关病原不检出;检测下限为2.4 copies/μL,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致。该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1 h,具有操作简便、快速、可现场化的特点,为IBRV的现场检测提供了一个可靠的方法。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍,需要加强监管。
【学位授予单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.653
【图文】：

荚膜,血清型,鉴定结果,病原

uler DAN Ladder；N：阴性对照；1~9：M. haemolyAN Ladder; N: Negative control; 1~9: Positive sample-1 部分 M.haemolytica 荚膜血清型 1、2 和 6 型鉴定entification results of the capsular serotypes 1, 2 and 6牛养殖业的发展，肉牛养殖数目显著增多，而由的影响，我国肉牛长距离、大范围的调运也病因复杂，不同病原引起的临床症状相似，仅主要作用。国外已有大量关于 BRDC 多病原混haemolytica 和 BVDV 是美国和加拿大致 BRDni、BRSV 和 BCoV 是致巴西 BRDC 的主要病原发 BRDC 的主要致病病原不同。本研究对采自鼻腔棉拭子样本中 10 种病原检测结果显示场阳性率和平均阳性率均较高，说明IBRV、M

序列,毒株,中引,细胞病变

件等对 gB 和 gC 基因编码区序列进行遗传进化分析，使用 MEGA 7 软件以Neighbor-Joining 法(Bootstrap 值为 1000)构建系统进化树，以了解 IBRV 分离株的 gB和 gC 基因与 GenBank 已公布的 IBRV 毒株之间的遗传进化关系。3 结果3.1 病毒分离及 PCR 方法鉴定结果将 10 份 IBRV 阳性深部鼻腔棉拭子接种于单层 MDBK 细胞中，盲传 3 代后，PCR方法(张颖慧等, 2018)检测显示 10 株细胞液中 6 株呈阳性。传至 4 代时，有一株在36 h 左右出现与 IBRV 阳性对照相同的典型的细胞病变。病变初期细胞开始出现圆缩的现象，之后圆缩的细胞逐渐出现拉网状，聚集成葡萄串样，随着时间的增加，在单层 MDBK 细胞上形成空洞，而正常的 MDBK 细胞阴性对照没有发生病变，见图 3-1。传至 5 代后，细胞病变稳定。通过 PCR 方法(张颖慧等, 2018)检测该病变株仍为阳性。

毒株,阳性对照,特异性,细胞膜

肉牛呼吸道疾病综合征的病原检测和 IBRV 恒温隔绝式荧光 PCR 方法的建立与应用3.2 间接免疫荧光鉴定结果通过间接免疫荧光鉴定，荧光显微镜下观察可见，分离株和 IBRV 阳性对照毒株的细胞浆中均出现了明亮的特异性绿色荧光，而 MDBK 阴性对照则未出现绿色荧光如图3-2。说明成功分离到1株致细胞病变的IBRV毒株，命名为IBRV/2018/SMU6352

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