应用不同分型方法对布鲁氏菌临床分离株基因分型的研究

发布时间：2020-07-25 09:36

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(.Brucella)属的细菌侵入机体引起的一类全球性分布的传染-变态反应性人畜共患传染病。该病不仅会给畜牧业带来重大的经济损失,还严重危害人类健康。依据对宿主偏好性、培养特性以及生物学特性的不同,将布鲁氏菌分为6个经典的种,分别为牛种、羊种、猪种、犬种、绵羊附睾种和沙林鼠种,其中牛种和羊种是最为常见的人布病的病原体。目前布鲁氏菌的分型方法主要有表型分型和基因分型,其中基因分型方法在布鲁氏菌快速种型鉴定,病原的溯源分析以及菌株之间的差异与联系等方面起到了重要作用。本研究旨在寻找一种快速、分辨率高的分型方法,对布鲁氏菌临床分离株进行基因分型,分析菌株的遗传多态性,建立菌株之间的系统发育关系,为我国布鲁氏菌病的分子流行病学和病原溯源研究提供依据。本研究通过收集临床分离的23株布鲁氏菌,综合运用16S rDNA、 AMOS-PCR.改良后的多位点序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)以及多位点可变数目串联重复序列分析(Multilocus variable number tandem repeat analysis,MLVA)等技术,对布鲁氏菌进行基因分型,分析各方法的特点并探讨临床分离株的遗传进化关系。23株布鲁氏菌分离株的16S rDNA序列经BLAST比对后,结果显示与布鲁氏菌的同源性最高,达到了99%以上。核酸序列相似性达到了99.85%,但不能区分种、型。采用AMOS-PCR对23株布鲁氏菌分离株进行种型鉴定,其中22株为羊种1、2或3型。1株为牛种1、2或4型。为了提高MLST方法的分析效率,本研究通过重新设计引物,加长扩增产物长度,使扩增产物的长度在750bp左右,建立了改良型MLST方法(EMLST).传统MLST方法(CMLST)九个基因的有效序列长度在422bp至589bp之间,而改良型MLST方法的有效序列长度在611bp至759bp之间,改良型MLST方法每个基因参与分型的有效序列长度增加了121bp-302bp,增加的比例在24.69%-71.56%之间。对23株布鲁氏菌进行了CMLST和EMLST的分析,CMLST方法定义了5个ST型,EMLST方法定义了10个ST型。九个基因中,glk、gyrB和Omp25基因增加了1个基因型。多态性位点的数量与该基因型别的多少成正比,通过加长每个基因的扩增序列,4个基因的多态性位点得到了增加。聚类分析结果显示,无论是基因型的分裂分解分析还是进化分析,EMLST与CMLST相比,均具有更多的分支,说明EMLST方法比CMLST方法的分型分辨率更高。国外来自30个国家的160株布鲁氏菌,一共被定义了27个ST型。本研究23株分离株共有5个ST型,其中有2个ST型与国外菌株一致,另外3个ST型为本研究新发现ST型,命名为ST28、ST29、和ST30,其中ST28为本研究的优势ST型。本研究采用测序的方法对23株布鲁氏菌分离株的16个多态性较高的MLVA位点进行分析,使用MLVA-8分型结果显示,22株为羊种,仅1株为牛种,其中羊种为115型,牛种为117型。使用MLVA-11和MLVA-16分型则没有发现与已知序列完全一致的基因型。对23株布鲁氏菌临床分离株16S rDNA、AMOS-PCR、CMLST、EMLST以及MLVA数据综合分析表明：16S　rDNA序列同源性分析能够实现对布鲁氏菌属的准确鉴定,对临床快速诊断布鲁氏菌病有重要作用,但不宜进行布鲁氏菌的种型鉴定。AMOS-PCR是一种快速、简便、准确的布病诊断方法,并能鉴定布鲁氏菌的种和部分生物型。EMLST方法分型分辨率高于传统MLST方法,可用于流行病学和菌群多态性研究,且适用于亲缘性较远的布鲁氏菌菌株。MLVA是本研究所有方法中分辨率最高的,适用于对亲缘性较近的布鲁氏菌进行基因分型以及流行病学溯源。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

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