chIFITM1对NDV的体外抑制作用研究

发布时间：2020-07-25 16:21

【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是严重危害禽养殖业的重要病原微生物。本团队前期研究发现,在NDV感染鸡的气管和腺胃中,干扰素和鸡干扰素诱导的跨膜蛋白1(Chicken interferon induced transmembrane protein 1,chIFITM1)显著上调表达。但是chIFITM1能否抑制NDV的复制及其影响因素,目前仍不清楚。本研究构建了chIFITM1的真核表达质粒pCAGGS-HA-chIFITM1,转染LMH和HD11细胞后检测发现chIFITM1蛋白均表达。然而,在LMH细胞中表达的chIFITM1并不能抑制NDV的复制,但在HD11细胞中表达的chIFITM1却能显著抑制NDV的复制。chIFITM1是干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)家族中的一员,目前研究表明IFITM的抗病毒作用主要与病毒的入侵途径及IFITM的亚细胞定位有关,因此我们推测chIFITM1在LMH和HD11细胞中抗病毒作用的不同可能与这两种因素有关。NDV可以通过直接的膜融合途径和内吞途径入侵细胞,膜融合途径是NDV入侵细胞的普遍途径,但NDV入侵不同细胞时采用的内吞途径可能存在差异。因此本研究通过检测NDV入侵LMH和HD11细胞的途径以及chIFITM1的亚细胞定位分析chIFITM1仅在HD11细胞中抑制NDV复制的可能机制。使用网格蛋白和小窝蛋白介导内吞途径的抑制剂Dynasore,网格蛋白介导内吞途径的抑制剂Chlorpromazine,小窝蛋白介导内吞途径的抑制剂PMA,巨胞饮内吞途径的抑制剂EIPA,吞噬内吞途径的抑制剂Wortmannin,处理细胞后检测其对NDV吸附、进入和复制的影响。结果显示,在LMH和HD11细胞中,以上5种试剂均不能抑制NDV的吸附,但Dynasore和PMA均能显著抑制NDV的进入和复制,而Chlorpromazine、EIPA和Wortmannin均不能抑制NDV的进入和复制。此外,本研究还发现,在病毒感染LMH和HD11细胞的早期阶段,NDV能够与早期内体marker EEA1共定位。使用细胞内体酸化的抑制剂Bafilomycin A1预处理LMH和HD11细胞后均能显著抑制NDV的复制。上述结果说明,在LMH和HD11细胞中,NDV均可通过小窝蛋白介导的内吞途径入侵细胞,但是NDV的内吞途径经过早期内体且依赖内体的酸化。上述试验表明,NDV入侵LMH和HD11细胞的途径相同,但chIFITM1仅在HD11细胞中能够抑制病毒的进入和复制,我们推测这可能与chIFITM1的亚细胞定位有关。通过激光共聚焦试验检测发现,在LMH细胞中chIFITM1主要定位在细胞膜表面;但在HD11细胞中chIFITM1主要定位在细胞膜表面和细胞内体中,并和EEA1有明显的共定位。本研究结果表明,chIFITM1在LMH和HD11细胞中的抗病毒作用不同是由于chIFITM1的亚细胞定位不同,即位于HD11细胞内体中的chIFITM1能够抑制通过内吞途径进入的NDV的复制,但存在于LMH细胞膜表面的chIFITM1对NDV的进入和复制没有显著影响。本研究揭示了chIFITM1抑制NDV进入细胞的作用及其可能的原因,为进一步探索chIFITM1抑制NDV感染的作用机制奠定了基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

19：DL 2000 DNA 分子量标准；1：chIFITM1 扩增；2：空白对: DL 2000 DNA Marker; 1: Amplicon of chIFITM1; 2: Blank contr图 3.1 chIFITM1 的 PCR 扩增Figure 3.1 Amplification of chIFITM1 by PCRCR 和酶切鉴定GGS-HA-chIFITM1 为模板，使用引物 chIFITM1-F/R 的琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像仪中进行观察，发期的目的条带大小一致，因此构建的质粒 pCAGGS-H使用 EcoRⅠ和 XhoⅠ同时酶切 pCAGGS-HA-chIFITM泳，在紫外凝胶成像仪中进行观察，发现在约 5 000A 载体的预期大小一致，另外，在约 342 bp 处有一条期大小一致，因此构建的质粒 pCAGGS-HA-chIFITM1

图 3.3 间接免疫荧光反应检测 chIFITM1 的表达Figure 3.3 Detection of the expression of chIFITM1 by IFAestern blotMH 细胞和 HD11 细胞中分别转染 pCAGGS-HA-chIFITM1，36 h 后收取细胞进行 W，在近红外荧光扫描成像系统中拍照发现，真核表达质粒 pCAGGS-HA-chIFITM1 在D11 细胞中均有较深的条带，这说明 chIFITM1 在这两种细胞中均成功表达（图 3

图 3.3 间接免疫荧光反应检测 chIFITM1 的表达Figure 3.3 Detection of the expression of chIFITM1 by IFA3.2.2 Western blot在 LMH 细胞和 HD11 细胞中分别转染 pCAGGS-HA-chIFITM1，36 h 后收取细胞进行 Westernblot 试验，在近红外荧光扫描成像系统中拍照发现，真核表达质粒 pCAGGS-HA-chIFITM1 在 LMH细胞和 HD11 细胞中均有较深的条带，这说明 chIFITM1 在这两种细胞中均成功表达（图 3.4）。

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本文编号：2770066